Clonage après purification sur gel

[invitea668c098]

Bonjour à tous,
Je suis en quête d'aide car je suis au bord de la déprime.
Cela va bien faire un an que je m'évertue à cloner un insert mais quasiment sans succès.
Je dois cloner mon insert dans un phagemid en lieu et place d'une cassette de résistance à la tétracycline (j'ai une autre résistance).
Je dois donc purifier mon plasmide sur gel après digestion (kit M&N et qiagen testé). Quoique je fasse, le clonage est impossible ensuite. J'ai bien sur essayer de le laver (miniElute de qiagen ou précipiation éthanolique). J'ai changé 3 fois de ligases! Alors que mon clonage fonctionne lorsque je ne purifie pas mon vecteur. Seulement, je me retrouve en compétition entre ma K7 de résistance et mon insert + des vecteurs non digérés. Comme il s'agit d'un phagemid, celui produira des phages et la présence de phage wt entrainera une plus grande infectiosité des phages wt vis a vis des phages clonés. Je me retrouverais à terme avec que des wt!
J'ai donc essayé de digéré mon plasmide ainsi que ma k7 de résistance (1 enzyme pour le vecteur mais 2 sites différents et 3 pour la k7 de resistance). Ce protocole n'a fonctionné qu'une fois. Depuis j'ai toujours des vecteurs ayant échappés à la quadruple digestion!!!
Je ne sais plus quoi tester. J'espère avoir été assez clair pour que vous puissiez me venir en aide.
Merci beaucoup d'avance!!!!
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[invitea668c098]

je voulais apporter quelques précision:
J'ai utilisé 3 types d'agarose de marque différentes, 3 kit de purification sur gel (Macherey & Nagel; Qiagen: produits chimiques / Millipore: Extraction par centrifugation sans produit pour fondre l'agarose). J'ai utilisé 3 ligases (NEB; Roche et Promega: tampons alicotés pour ne pas dégrader l'ATP).
J'ai testé plusieurs protocoles de digestion du plasmide et de l'insert (de 4h à O/N de digestion). Déphosphorylé ou non pour le vecteur.
Ce protocole n'a fonctionné que 2 fois les 2 seules fois où mon boss me supervisait (la grosse loose!!!). Je suis même en train de suspecter le SYBR dans le gel ou le tampon de charge des échantillons tellement je suis désespéré!!!
J'espère vraiment que quelqu'un pourra m'aider!!!

[invite71f23525]

As-tu déjà essayé de purifier ton ADN avec un kit de purification de produits de PCR? J'avais commencé mes clonages avec un kit de purification sur gel. Le problème est que le rendement de ce genre de kit est souvent faible. Cela occasionne une grosse perte de matériel, surtout au bout de 3 ou 4 purif. Cela ne règlera pas ton problème, mais ça pourrait contribuer à le résoudre. Je n'ai pas compris grand chose à ta stratégie de clonage, surtout parce-que tu n'as joint aucun schéma (carte du vecteur par exemple).

J'ai une petite idée qui vaudra ce qu'elle vaudra. Pour enlever ta cassette de résistance, as-tu pensé à amplifier ton vecteur par PCR en prenant des amorces qui excluent la cassette de résistance (et qui incluent en 5' de tes amorces les sites de restriction plus quelques bases en 5' de chaque site de restriction pour pouvoir les cliver par la suite)? Si ton vecteur provient de bactéries, il sera méthylé. L'amplification par PCR va donner des amplicons non méthylés (et aussi ne contenant plus ta cassette vu que l'amplification du vecteur exclura la cassette) . Tu ajoutes à ton produit de PCR l'enzyme DpnI qui va cliver l'ADN méthylé en fragments de quelques centaines de bases (enzyme de restriction reconnaissant un site de 4 bases méthylé). Ainsi, seul ton vecteur d'origine (celui contenant ta cassette) sera digéré par cette enzyme, et pas ton produit de PCR, ce qui te permet de bien te débarrasser de ta cassette.Cela pourrait être une stratégie de rechange par rapport à ta stratégie actuelle qui est de simplement extraire la cassette avec des enzymes de restriction correspondant à ton futur site d'insertion.

[invitea668c098]

Le probleme des kit de purification pcr c'est qu'ils ne dépassent les 4kb. Mon plasmide faisant 4.2kb j'en perds tout autant qu'avec une purification sur gel.
Votre approche est interessant mais pas applicable dans mon cas. L'intérêt de la k7 de resistance de 2000 pb est un témoin de digestion du phagemid. Dans votre stratégie, au lieu de purifié un produit de digestion, je puriferais sur gel un produit PCR! Je garde cela en tete mais je doute... De plus je devrais digérer un fragment linéaire au lieu d'un circulaire ce qui est beaucoup moins efficace.

Merci pour votre réponse et votre aide

[A voir en vidéo sur Futura]