Problème DAPI & Cellules

[invitea74316c7]

Bonjour à tous,
Je viens à vous car je suis un peu déspespéré. Voila maintenant un long moment que je travail avec des HEK 293 ECACC sur lesquels je réalise des immunocytochimie afin de marquer une protéine. Au départ tout fonctionnait bien mais depuis quelque temps j'obitiens des résultats étrange avec mon marquage au DAPI. Comme vous pouvez le voir sur l'image ci dessous, les noyaux sont bien visible mais il y a une sorte d'élément filamenteux présent sur toutes mes lamelles. De quoi s'agit il et d'ou cela peut il provenir??

Je travail donc sur des HEK 293, elles sont utilisée sans antibiotique et ne sont pas contaminées. Pour la fixation: PAF 4%. Le DAPI est ajouté a la fin durant 5 minutes. Puis les lamelles sont montées sur une lame à l'aide de MOWIOL. Merci de votre aide!


Image transférée en pièce jointe pour faciliter sa visualisation.

LXR
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[invitec9f0f895]

salut

c'est l'ADN des mitochondries, ou des mycoplasmes.

Yoyo

[invitea74316c7]

Salut,
Tu parle de l'ADN des mitochondries mais en téhorie on ne devrait pas vraiment le voir non? Du moins sur les différentes immuno que j'ai pu faire je n'ai jamais fais attention à cela!

[invitec9f0f895]

salut

personellement en DAPI c'est principalement l'ADN mitochondriale que je marque.
Mais dans ton cas je pencherait possiblement vers une contamination par des mycoplasmes. Tu as vérifié?

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

J'ai déjà eu ce genre de problème alors que les cellules étaient négatives au test myco (avec témoin positif et négatif bien sûr). A ce moment là, pour je ne sais qu'elle raison les cellules étaient stressées : elles étaient granuleuses et il y avait quelques débris cellulaires mais sans exagérer non plus (inférieur à 5% de la surface). J'ai donc pensé que cette sorte de contamination marquée en DAPI pouvait être le noyau de cellules lysées (nécrose par exemple). J'ai décongelé une nouvelle ampoule de ma lignée et je n'ai plus observé ce phénomène.

Donc quoi que ce soit, si tu possèdes cette lignée dans l'azote, je te conseille de relancer ta lignée avec une nouvelle ampoule, ça devrait résoudre le problème.