Mise au point des conditions PCR

[invite6a6b1a73]

Bonjour,

Je dois amplifier un grand nombre de gènes, j'ai désigné des amorces spécifiques et pour un certain nombre, j'ai rencontré des problèmes.

*Pour 10% de mes gènes environ, je n'ai pas d'amplification. J'ai essayé différentes méthodes: augmentation du volume de réaction, diminution de la quantité d'ADN, baisse du Tm de 58 à 56°C. Rien n'a fonctionné, je cherche donc d'autres méthodes qui pourraient améliorer mes conditions PCR.

*La plupart de mes gènes appartiennent à des familles multigéniques. Pour 30% de mes amplifications, je me retrouve donc avec plusieurs bandes. Est-il possible de ne récupérer qu'une seule bande rien qu'en changeant les conditions PCR? ou part un autre manière?

*Enfin, pour certains de mes amplicons, le gel n'a permis de ne visualiser qu'une seule bande nette, cependant au séquençage (GATC), j'obtiens des séquences pourries, quelqu'un a-t-il une explication?

Je sais que ça fait beaucoup de questions. Merci d'avance de les avoir lues et de prendre le temps de me répondre
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[invitecc2a5091]

Bonjour,

Je peux donner quelques idees de reponses.
Je pense qu'il s'agit de PCR classique et non QPCR.
Pour les 10 % de genes qui n'amplifient pas: revoir si le gene est present dans le tissu etudié et l'espece. Si oui il se peut qu'il soit faiblement exprimé et qu'il n'y ait pas de signal. Les primers ne sont pas corrects ou il y a un bug dans les réactifs mais à mon avis vu que d'autres genes fonctionnent ce ne sont pas les reactifs.
Pour les multibandes, on peut augmanter la specificité en jouant egalement sur la C° en MgCl2 et en priemers ou l'augmentation de la temperature. Un gradient aussi . Sinon revoir les primers.
pour le sequançage je ne connais pas et je ne sais pas ce que veut dire "pourries".
Bon courage

[invite6a6b1a73]

Tout d'abord merci d'avoir pris le temps de répondre.

*Pour les 10 % de genes qui n'amplifient pas: les primers ont été désignés à partir d'un séquençage haut débit d'ADNc d'un individu "témoin". Donc les gènes que je recherche à partir de mes amorces sont forcément présents dans le génome de toutes les cellules de l'organisme "témoin" (même espèce, même variété, même individu). Et pour un même mix j'ai des gènes qui fonctionnent et d'autres non. Donc je cherche en fait un moyen d'améliorer la "puissance" de ma PCR.

* Pour ce qui est des augmentations de concentrations de MgCl2, d'amorces et de températures, j'aimerais savoir dans quel ordre de grandeur je peux faire varier ces paramètres. ex: 1, 10, 30mM MgCL2? Tm+5, 10?

*Enfin, pour le séquençage, j'obtiens des chromatogrammes avec de nombreux pics superposés les uns sur les autres.

[invite3a8d59d9]

Je fais actuellement une grosse mise ua point pour un multiplexage.

J'ai donc utilisé des gammes de mgcl2, en prenant d'abord une classique (en utilisant pour base du mgcl2 à 50mM et sur un volume réactionnel de 50µL): 2/3/4/5/6/7/8/9/10 µL.

Ensuite j'affinais ma gamme par exemple si cela marchait pour 5 et 6, je fesais une gamme intermédiaire afin d'obtenir le meilleur résultat possible: 5/5.2/5.4/5.6/5.6/6.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite77ed5d40]

Est ce que tu purifies ton produit de PCR avant le séquencage? Tes résultats laissent à penser qu'il y a plusieurs amorces dans ta réaction de séquence.