Pcr 16s ADNr qui présente des hybridations non spécifiques!

[invite7b94aa4d]

Salut tout le monde: Voila mon probléme:
J'ai plusieurs souches bactériennes non identifiées que je voudrais identifier grace à la PCR 16s de l'ADNr. Le résultat de la migration sur gel d'agarose à 1% révèle: le résultat suivant:
- toutes mes bandes identifiants le gène 16s sont là mais il y a pour la plus part des échantillons la présence de bandes non spécifique de plus petite taille.!
J'ai refais la pcr en variant:
- T° d'hybridation (65° au lieu de 55°)
- l'amorce
Est ce que quelqu'un peut m'aider pour avoir un profil sur gel assez correcte contenant uniquement ma bande 16s.

Merci d'avance.
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[kamor]

Tu peux aussi réduire le temps de l'hybridation et de l'élongation, plus ceux ci sont longs plus les amorces pourront se fixer sur des sites sensiblement équivalents aux séquences d'intérêt. Un bond de 10°C... c'est quand même énorme, le mieux est de disposer d'un thermocycleur pouvant faire des gradients sur la plaque, mais bon, il faut qu'il soit quand même récent.

je suppose que tu as fait varier la concentration d'amorces ? Oui c'est possible que ça limite la formation de brins complémentaires en diminuant la concentration, ou que l'intensité des bandes diminuent.

Tu peux aussi faire varier la concentration de MgCl2. Là je dirais plutôt la diminuer, pour limiter l'annealing aspécifique.

[invite7b94aa4d]

Voici le cycle que j'utilise:

• 95°C for 5min

• 95°C for 30s
• 55°C for 30s Cycle 30 times
• 72°C for 1.5min

• 72°C for 10min

• 4°C hold
Je vais essayer de diminuer la concentration de mes amorces, actuellement j'utilise une concentration finale de 1 µM dans mon master mix.

Est ce que je c'est trop élevé?

Pour le Mgcl2 il est déja dans mon buffer donc fixe.

Merci à tous d'avance

[invite899b80e1]

J'ai déja eut le ca quand j'ai voulu sequencer l'ADN codant pour l'ARN 16s avec des bandes plus petites et plus grandes. Pas d'affolement aux séquencage il je n'ai pas eut de problèmes (peut etre un ou deux séquancage de pourrie sur 450). Oublie pas qu'il peux y avoir plusieurs copies du 16s dans ton génome.

Vu ton temps d'élongation tu cherche surement à sequancer les 1500pb? je me trompe? Si tu n'a pas besoin des 1500pb tu pourrai changer tes amorces pour amplifier des fragments plus courts.

[A voir en vidéo sur Futura]