Quantification absolue / gamme étalon

[Nosnibor]

Bonjour,
J'utilise la PCR quantitative, quantification absolue avec une gamme étalon obtenue par dilution de quantités connues d'ADN. Je cherche à déterminer les quantités d'ADN d'échantillons. Je travaille en SYBR Green. Mon efficacité de PCR et la spécificité de mes amorces sont OK.
J'ai réalisé 3 dilutions différentes du même échantillon, toutes sont couvertes par la gamme étalon. Par contre, pour chacune des dilutions, avec la même gamme étalon, je trouve un résultat différent (après avoir fait les calculs) alors qu'en théorie je devrais trouver au final la même valeur (la seule et unique valeur vraie de mon échantillon) !!
Alors, quelle dilution me donne la bonne valeur ??
Pourquoi est-ce que les résultats sont fonction de la dilution appliquée à l'échantillon ??
Merci !
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[Flyingbike]

sans doute parce que dans ton échantillon inconnu l'efficacité n'est pas la même sur la gamme de dilution étudiée.

[invite75e918c6]

Les écarts types entre ces valeurs sont t'elles énormes? Sinon, je dirais que c'est la valeur intermédiaire la plus sur car vers la fin de la PCR on tend vers un plateau et au début on est dans une phase d'accélération donc il est préférable de prendre une valeur qui se situe lors de la phase exponentielle.

http://www.ijm.fr/uploads/RTEmagicC_amp_p62735.jpg
http://cochin.inserm.fr/research/tec...ges/thumb.jpeg

Après, je ne sais pas l'allure de la courbe obtenue par votre étalon

[Flyingbike]

Je ne pense pas que ça soit ça dont parle Nosnibor.

Son problème est que le CT obtenu (donc indépendant des phases que du décris) ,n'est pas propotionnel a la dilution de l'échantillon (ce qui devrait).

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite75e918c6]

C'est vrai, je n'ai pas penser aux CT ^^

[Nosnibor]

Merci Flyingbike pour ce conseil avisé !!
Il se peut en effet que mon efficacité de PCR soit différente pour la gamme étalon et pour l'échantillon !! L'ADN est extrait de bactéries et ces bactéries sont dans des matrices différentes pour la gamme étalon et pour l'échantillon...