Problème de spécificité en RT-qPCR

[inviteaa47b644]

Bonjour,

Je travaille actuellement sur une RT-qPCR en une étape afin de détecter la présence ou absence de pathogène dans l'environnement. Les amorces et la sonde TaqMan sont définies par une norme européenne, je ne peux donc pas les changer.

La courbe standard a un domaine de linéarité limité (2log) et je vois apparaitre des points disparates après une valeur de Ct de 37. Les contrôles négatifs (de l’étape d'extraction ou de l’étape de PCR : l'échantillon est remplacé par de l’eau ultra pure) montrent de manière aléatoire des amplifications. J'ai pensé à une contamination mais cela ne se produit qu'avec ce pathogène et malgré un changement régulier des réactifs, nettoyage complet….

J'ai supposé une aspécificité de mes amorces ou sondes mais lorsque je réalise un gel d'agarose sur ces échantillons ou témoins négatifs avec une amplification, j'observe la bande d'intérêt.

J'ai aussi réalisé une RT puis qPCR en SYBR Green qui confirme que certains échantillons sont positifs mais pour les autres j'ai des Tm proches (74°C ou/et 82°C contre 79°C prévu pour l'amplicon désiré).

J'ai voulu séquencer à partir du gel mais mon fragment est très petit (86pb) et la quantité trop faible….

Donc ma question : que puis je faire pour éliminer cette aspécificité ou du moins la caractérisée? Si quelqu'un comprend le fonctionnement de cette PCR, j'avoue être en panne d'option.

Merci d'avance…
-----

[invite5df81ccf]

Bonsoir,
A mon avis, c'est une contamination, puisque tu contrôle sur un gel d'agarose et tu trouve la taille de ton amplicon, et surtout que tu as utilisè la sonde TaqMan qui est hyper specifique.

Ce que je te propose, c'est de bien nettoyer et désinfecter tes hottes avec du DNAaway et du RNAaway, et lancer les UV en changeant ton eau ultrapure et en la mettant sous UV aussi. Ressai ça et tiens moi au courant!

Je suis dans un laboratoire de Virologie Medicale et de biosecuritè 3, quand la même chose m'arrive c'est automatiquement une belle contamination. Donc nettoyage et desinfection font l'affaire.

Bon courage,
Cordialement,
Doctorante dans la virologie de l'environnement

[inviteaa47b644]

Bonjour,

Merci de votre réponse,
Nous avons aussi pensé à une contamination et tout nettoyé mais rien n'a changé.
Un laboratoire en collaboration avec nous réalise la même PCR et observe les mêmes produits de manière aléatoire.
Il semblerait que cela soit dépendent du rendement de la technique.
Je n'observe pas ce phénomène pour des rendements supèrieurs à 40%. Mais je ne sais toujours pas ce qui peut expliquer ces résultats.