Bonjour, j'ai un exercice assez long à préparer concernant la cartographie génétique par conjugaison et transduction.
J'ai traité la majorité des questions, et j'aurai aimé savoir si mes réponses sont justes ou si on peut encore affiner les réponses.
A partir de la question 12 (pièce jointe associée), je suis un peu perdue, donc si quelqu'un pouvait m'expliquer, ce serait sympa ^^
L'exercice est un exercice de TD de L2 à faire pour la rentrée (c'est à dire dans une semaine et demi).
Voici l'énoncé :
A partir d'une souche sauvage d'E.Coli portant un gène de résistance à la streptomycine (phénotype StrR) et capable de croître à 30°C comme à 42°C (phénotype thermorésistance TR), on obtient un mutant spontané A thermosensible. Ce mutant est incapable de croître à 42°C (phénotype TS). On constate que ce mutant a également acquis un autre phénotype, à savoir la résistance à l'acide nalidixique (NalR). On appellera l'allèle conférant le phénotype sauvage de thermorésistance tr, et l'allèle conférant le phénotype mutant de thermosensibilité ts.
Pour localiser la mutation conférant le caractère TS, la souche A est croisée avec 5 souches Hfr dérivées de la souche sauvage, mais résistantes à 2 antibiotiques : tétracycline (gène tetR) et kanamycine (gène kanR). Ces gènes de résistance sont portés par des transposons et leurs positions dans le génôme sont variables d'une souche à l'autre. Pour chaque souche Hfr, la position et l'orientation de l'origine de transfert (oriT) et les localisations des gènes tetR et kanR sont indiquées dans le tableau ci-dessous :
(Positions en min)
Hfr1 : oriT=90 (sens aiguilles d'une montre) / kanR=10 / tetR=70
Hfr2 : oriT=60 (sens aiguilles) / kanR=40 / tetR=80
Hfr3 : oriT=45 (sens aiguilles) / kanR=25 / tetR=65
Hfr4 : oriT=35 (sens inverse aiguilles) / kanR=15 / tetR=55
Hfr5 : oriT=5 (sens inverse aiguilles) / kanR=25 / tetR=85
Après 20 min de croisement, les étalements sont effectués à 30°C sur milieu contenant de la streptomycine et un des 2 antibiotiques auxquels sont résistantes les souches Hfr.
Q1. Pour chaque croisement, quel doit être le 2ème antibiotique ajouté dans le milieu de sélection ? Justifiez.
R1. On doit mettre l'antibiotique qui a son gène le plus proche de oriT en faisant bien attention au sens du transfert. Ce gène a plus de chance d'être transféré vu qu'il est près de l'origine de transfert.
Soit pour :
Hfr1 : MM (Milieu minimum) + tetracycline
Hfr2 : MM + kanamycine
Hfr3 : MM + kana
Hfr4 : MM + tetra
Hfr5 : MM + kana
On détermine ensuite par répliques à 2 températures le phénotype TS ou TR des recombianats obtenus sur le milieu de sélection. Les résultats sont les suivant :
Phénotype des recombinants obtenus :
Hfr1 : TS
Hfr2 : TS + TR
Hfr3 : TS
Hfr4 : TS + TR
Hfr5 : TS
Q2. Quelle est la localisation génétique de la mutation responsable du phénotype TS dans la souche A? Justifiez.
R2. Pour Hfr1, tous les conjugants sont TS, l'allèle TR ne passe donc pas dans ce 1er transfert. TR n'est pas entre 70 à 90 (20 min).
Hfr2 : On obtient des recombinants TS et TR, donc TR passe, donc il est entre 40 et 60 (20 min).
Hfr3 : Même raisonnement, TR pas entre 25 et 45 (20min).
Hfr4 : TR entre 35 et 55 (20min).
Hfr5 : TR pas entre 5 et 25 (20min).
D'après ces résultats, on peut conclure que TR se trouve entre 45 et 55 min.
Un lysat de phages P1 est obtenu sur une souche B d'E.Coli portant un gène de résistance au chloramphénicol (gène cmR) et à la spectinomycine (gène spcR). Hormis ses caractères mutants CmR et SpcR, la souche B est de génotype sauvage. La position relative des gènes cmR et spcR est inconnue.
Ce lysat est utilisé pour infecter la souche A.
Dans une 1ere analyse, 100 transductants CmR sont sélectionnés et testés pour leur phénotype TS/TR. Ils se répartissent comme suit :
-Transductants CmR, TS : 50
-Transductants CmR, TR : 50
Q3. Les gènes cmR et ts sont-ils co-transductibles? Justifiez votre réponse. En règle générale, quelle est la distance maximale (en min de la carte et en kb d'ADN) entre 2 gènes considérés comme co-transductibles? Quel paramètre biologique détermine cette distance ?
R3. cmR et ts sont co-transductibles mais pourquoi en vu des résultats ?
La distance max entre 2 gènes co-transductibles : 100 kb soit environ 2 min (car 4640 kb = 100 min).
Paramètre biologique : le volume de la capside du phage (peut contenir 100kb maxi).
Q4. Si ces gènes sont co-transductibles, quelle est la distance les séparant exprimée en fréquence de co-transduction (co-T)?
R4. [CmR, TR]/[CmR] = 50/100 = 0,5
Dans une 2ème analyse, 100 transductants sont sélectionnés pour leur phénotype SpcR puis testés pour leur phénotype TS/TR. Répartition :
-Transductants SpcR, TS : 100
-TRansductants SpcR, TR : 0
Même si 10 fois plus de transductants SpcR sont analysés, la proportion ne change pas.
Q5. Les gènes spcR et ts sont-ils co-transductibles ? Quelle est la distance minimale (en min et en kb) entre ces 2 gènes ?
R5. Non, pas co-transductibles mais je ne sais pas pourquoi ? Car le nombre de transductants SpcR, TR = 0 ? D'où la fquce de co-T = 0 donc pas de liaison génétique ?
Distance minimale entre ces 2 gènes : 100 kb ou plus.
100 transductants SpcR analysés dans la question Q5 sont testés pour leur phénotype CmR/CmS. Répartition :
- Transductants SpcR CmR : 3
- Transductants SpcR CmS : 97
Q6. Les gènes spcR et cmR sont-ils co-transductibles ? Si oui, quelle est la distance les séparant exprimée en fréquence de co-transduction ? A l'échelle de la transduction, ces 2 gènes sont-ils considérés comme étant très proches ou très éloignés l'un de l'autre ?
R6. spcR et cmR sont co-transductibles mais même problème, comment on peut le savoir en fonction des résultats ?
Fquce co-T = [SpcR, CmS]/[SpcR] = 3/100 = 0.03
Ils sont éloignés mais sur le même fragment (plus la fréquence est petite plus ils sont éloignés, si on a zéro = pas de liaison génétique).
Certaines écoles de génétique béctérienne préfèrent exprimer la distance entre les gènes en fréquence de recombinants (FR) déterminée par l'approche de transduction.
Q7. Quelle serait alors la distance entre spcR et cmR exprimée enn FR ?
R7. FR = [SpcR, CmS]/[SpcR] = 97/100 = 0,97
Q8. Selon ce mode de calcul, quelle serait la distance entre 2 gènes non co-transductible ?
R8. Ce serait l'inverse du raisonnement avec les fréquences en co-T, donc 1 (100/100).
Q9. Dessinez une carte génétique montrant la position relative des ces 3 gènes : spcR, cmR,tr/ts, dans l'ordre et indiquez la distance en co-T et FR.
R9. Entre tr et spcR : disatance en co-T = 0 et en FR=1.
co-T : ---|---0,5---|------0,03------|------
FR : ...tr<.0,5.>cmR<....0,97....>s pcR....
On remarque également que tous les transductants CmR et TR sont sensibles à l'acide nalidixique (NalS), alors que tous les transductants CmR TS sont résisants à l'acide nalidixique (NalR).
Q10. Quelle conclusion génétique découle de cette observation ?
R10. On ne peut pas disscocier NalS à TR et NalR à TS. Donc s'il y a une mutation de T (TR, phénotype sauvage, devient TS), cela confère a la bactérie une résistance à l'acide nalidixique (la bactérie "sauvage" NalS devient NalR).
Les bactéries de la souche A (voir début du TD) sont étalées en grande quantité sur un milieu complet et les boîtes sont incubées à 42°C. Malgré leur phénotype initial de thermosensibilité, quelques colonies poussent dans ces conditions. Elles sont donc à nouveau thermorésistantes (TR). Ces révertants se répartissent en 2 classes : les uns NalR, alors ques les autres deviennent NalS.
Q11. Quels évènements génétiques peuvent expliquer l'apparition des ces révertants phénotypiques ?
R11. Il y a eu une mutation, on parle de suppresseur intra ou extragénique (on ne peut pas savoir encore).
On étudie ensuite une colonie révertante de type NalS (souche K) et une autre de type NalR (souche M). Le croisement de la souche K avec n'importe quelle souche Hfr sauvage (TR, NalS) donne toujours des recombinants TR, NalS.
Q12. Quel est le génotype de la souche K ? Expliquez votre raisonnement par un schéma.
R12. Phénotype de K [TR, NalS] x Hfr [TR, NalS] ---> [TR, NalS]
Quelqu'un m'a dit qu'il s'agit en fait d'une mutation extragénique mais je comprends pas son raisonnement...
Génotype de K : tr nalS ou ts nalS supTR (suppresseur qui fait qu'on a un phénotype TS qui devient TR ) ???
Si on croise la souche M avec les 5 souches Hfr décrites précédemment - une conjugaison de 20 min et l'utilisation des milieux de sélection déterminés à la question Q1 - on obtient les résultats suivant :
- pour les croisements avec Hfr1 et Hfr3, tous les recombinants, résistants aux antibiotiques utilisés pour la sélection, sont de phénotype TR NalR.
- pour les croisements avec Hfr2 et Hfr4, tous les recombinants, résistants aux antibiotiques utilisés pour la sélection, sont de phénotype TR. Ils peuvent être néanmois soit NalS soit NalR.
-pour les croisements avec l'Hfr5, les recombinants résistants aux antibiotiques utilisés pour la sélection, sont soit TS soit TR. En revanche, ils sont tous NalR.
Q13. Ces résultats, indiquent-ils que le mutant M est un révertant vrai ou un révertant intragénique ? Pourquoi ?
R13. Je n'ai aucune idée là...
Q14. Quelle autre hypothèse peut expliquer ces résultats ?
R14. ???
Q15. Quel est le génotype de la souche M ? Décrivez les croisements avec les souches Hfr1 et 3, et avec les Hfr2 et 4.
R15. On sait grâce à l'énoncé que M a un phénotype [TR, NalR].
Son génotype ne peut être tr nalR car tr est indissociable de nalS ?
Donc son génotype serait plutot ts nalR supTR ?
Q16. La souche Hfr5 peut-elle dans les conditions de la conjugaison utilisées (20 min de transfert) transférer l'allèle sauvage tr ?
R16. ???
Q17. Donnez les génotypes des recombinants TR et TS obtenus après conjugaison avec Hfr5 ?
R17. ...
Q18. Indiquez sur le chromosome de la souche M les régions dans lesquelles se positionnent les gènes impliqués dans son phénotype TR.
R18. ...
FIN
Bravo à tous les courageux pour être arriver à la fin !
-----