Western Blot: Transfert incomplet

[invitef5962f47]

Bonsoir,

Je vais donc expliquer mon problème, je cherche a détecter la présence ou non d'une protéine nucléaire dans différentes lignées cellulaires (293, HeLa, U2OS...), pour cela j'ai donc lysées mes cellules en utilisant le tampon RIPA.

Jusque là tout va bien mais malgré un bon nombre d'essai je n'arrive pas à avoir un transfert complet de mes extraits protéiques sur ma membrane. Ma protéine fait 80 kDa et j'utilise un appareil de transfert liquide (Bio-Rad) avec des membranes de nitrocellulose. Préalablement au transfert, j'équilibre ma membrane pendant 10 à 20 minutes dans le tampon de transfert et je laisse mon gel 30 min avec agitation dans le tampon de transfert pour enlever le SDS.
Pour le moment j'essaie de transférer 20 ug de protéines par puits, les transferts sont faits à 100V à 4°C avec un agitateur dans la cuve, le temps de transfert allant de 1h à 2h45 (avec un meilleur transfert dans le dernier cas mais il doit encore rester 30 à 40% des protéines dans le gel). Au début j'utilisais un tampon de transfert contenant 20% de Méthanol avec 25 mM de Tris Base et 190 mM de Glycine. J'ai entre temps diminuer la concentration de Méthanol à 10% et j'ai donc observé un meilleur transfert. J'ai aussi essayé avec des gel de 0.75 mm et 1.5 mm mais je n'ai pas vu de différence flagrante dans l'efficacité de transfert.

Je compte essayer demain un transfert overnight et peut être essayer avec un tampon de transfert sans méthanol. Donc si quelqu'un à une idée je suis preneur.

Merci d'avance.
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[invitea74316c7]

J'ai une question bête: comment déduit tu que le transfert de protéine est incomplet?

[Yoyo]

Salut

Deja tu peux remplacer le Methanol (toxique) par de l'ethanol. Ensuite quel est ton pourcentage de gel? tu pourrais utiliser un transfert semi sec.

YOyo

[invitef5962f47]

J'ai une question bête: comment déduit tu que le transfert de protéine est incomplet?

Apres le transfert, je colore le gel avec du Bleu de Coomassie et si des bandes sont encore visibles c'est que le transfert est incomplet.

Deja tu peux remplacer le Methanol (toxique) par de l'ethanol. Ensuite quel est ton pourcentage de gel? tu pourrais utiliser un transfert semi sec.

L'ethanol a le même effet que le méthanol ? Sinon je fait des gels a 10% et pour le transfert semi-sec, le probleme est que je n'ai pas d'appareil pour dans mon labo et si je me souviens bien c'est surtout conseillé pour les protéines de moins de 60 kDa non ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea74316c7]

Apres le transfert, je colore le gel avec du Bleu de Coomassie et si des bandes sont encore visibles c'est que le transfert est incomplet.



L'ethanol a le même effet que le méthanol ? Sinon je fait des gels a 10% et pour le transfert semi-sec, le probleme est que je n'ai pas d'appareil pour dans mon labo et si je me souviens bien c'est surtout conseillé pour les protéines de moins de 60 kDa non ?

Ok j'avais jamais procédé ainsi! Alors moi j'ai toujours travaillé avec de l'ethanol mais je n'ai jamais rincé mon gel avant le transfert. J'ai simplement sorti le gel que je plaçais dans ma boite de transfert!

[Flyingbike]

essaie de mouiller ta membrane quelques secondes dans l'eau avant le tampon.

Tu peux essayer un transfert a 5V overnight a 4°, ca donne de bons résultats chez moi.
Dans ces cuves ça fait a peu pres 4 ou 5mA.


Verifies aussi le pH de ton eau et de ton tampon.