Hello à tous,
Je dois réaliser pas mal de PCR mais j'ai un petit doute quant à la temperature de melting que je dois utiliser: dois je utiliser la basic ou la base-stacking?
Il s'agit de PCR avec des amorces simples pour effectuer de la détection.
A partir de la Tm calculé vous conseillez de retirer combien de degré pour effectuer la PCR?
Il y a de nombreuses façons de calculer un TM, qui dépend à la fois de l'oligo et des composants du milieu réactionnel. Pour cette raison, il est préférable de commencer plus froid, et d'augmenter le TM en cas de produit non spécifique. L'idéal étant de travailler sur une machine a gradient qui permet de faire dans le même run une hybridation sur une gamme de température prédéfinie, permettant ainsi de choisir la meilleure.
Salut,
En fait ma question est de savoir quelle formule est la plus correcte dans mon cas car bien entendu les deux ne donnent pas du tout les mêmes valeurs de melting temperature!
Si l'appareil le permet, le plus simple est de faire un gradient sur une plaque, allant de l'une des températures à l'autre.
Attention aussi, suivant la formule utilisée, la concentration en MgCl2 est prise en compte ou non, ce qui peut faire varier sensiblement la Tm.
Mon appareil PCR ne permettant pas les gradients, c'est la raison pour laquelle je cherche à savoir si je dois plutot me référer à celle calculée par la méthode basique ou celle par l'autre méthode!!Envoyé par kamor
La base-stacking method utilise les concentrations de MgCL2 ainsi que la concentration en sel et amorce.
Salut,
Perso je fais toutes mes PCR a 50C. Quand je fais mon design j'essaie d'avoir ~50 a 65% de GC.
Dans 99% des cas ca passe nickel. Si ca deconne (non spe), je passe a 55C et je recommence. J'ai jamais eu de problemes. Si j'ai rien a 50C je redesign mes primers.
Ne te prend pas la tete avec ca, de toute maniere le Tm c'est vraiment pas un truc precis. En theorie le Tm correspond a 50% d'hybridation... alors un peu plus ou un peu moins...
A+
Peut être pas descendre "aussi bas" mais dans ce cas, prends la température la plus basse, tu es sur d'amplifier. Après si ton échantillon est complexe et tes amorces peu spécifiques, tu pourras essayer d'augmenter ta température.
Aucune complexité dans mes amorces ou templates! Je vais commencer avec 60°C, qui coresspond à la plus basse Tm moins 5°C. On verra bien
