protocole de culture cellulaire

[invite22f28294]

Bonjour, je suis en train d'effectuer un stage dans un pays anglophone et je ne comprends pas tout (pas grand chose même). On m'a expliquer comment faire des cultures cellulaires mais je ne comprends pas toutes les étapes et on m'a expliquer le protocole dans le désordre et pas de manière très complète. j'aimerais connaitre si possible un protocole de préférence avec les étapes dans l'ordre lol.

Voici le peu que j'ai compris :

Alors voilà, au début j'ai des cellules de rein de souris déja préparé et après diverses étapes, j'obtiens des fibroblastes. Comment fait-ton pour obtenir uniquement des fibroblastes ?

Je sais que j'utilise du dmem avec de la glutamine puis de la trypsine et de l'edta aussi mais je me souvient plus a quel niveau et puis j'utilise aussi du pbs pour laver des flacons (rectangulaires et je ne sait leur petit nom de ces flacons ^^).
A un moment, j'utilise un virus et des bactéries mais je ne comprends pas trop pourquoi ni trop a quel moment. On utilise un antibiotiques pour faire une sélection de bactérie ou quelques chose comme ca avec de la pénicilline et un kit qiagen dont je ne connait ni le nom ni l'action et ni a quel moment on l'utilise. Enfin bref je suis vraiment perdu (on m'a expliquer en 30 minutes la manip) mais si quelqu'un arrive a comprendre et à m'expliquer la manipulation (ou du moins une partie), ca serait sympa ! Le but est d'avoir des cultures cellulaire a la fn.

Merci beaucoup

PS : en utilisant la fonction rechercher je suis tomber sur ceci et du coup je pense que la souche utilisé est du NIH 3T3.
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[Edelweiss68]

Bonjour,

Avez-vous un protocole écrit ?

[invite22f28294]

Non malheureusement. Le chercheur qui m'a expliquer la manipulation m'a dit que c'est une technique utiliser de partout, c'est tout. Je n'ai aucun document et il n'en a pas.

[Edelweiss68]

Vous devrez maniper ou simplement comprendre le principe d'une culture cellulaire ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite22f28294]

Vous devrez maniper ou simplement comprendre le principe d'une culture cellulaire ?

Je vais devoir maniper seulement mais si je comprends çela serait un plus pour mon rapport de stage et ma soutenance que je dois faire après. Mais bon pour l'instant je me contenterait de savoir maniper.

[inviteba148c21]

Salut,

Alors avec toutes ces informations en vrac, ce n'est pas évident de comprendre vraiment ce que tu fais.
Pour un protocole de culture cellulaire, ou plutot de passage des cellules, je peux t'en donner un simple :

Tu as en culture tes cellules 3T3 que tu maintients à 37°C, 5% CO2, dans un incubateur avec comme milieu de culture un milieu DMEM supplémenté en SVF (10% je penses), de la glutamine et des antibiotiques. Ca c'est le classique pour entretenir (faire se multiplier) tes cellules.

Ensuite, lorsque tu as besoin de "passer" tes cellules, c'est à dire de transferer une partie de ta culture dans un nouvelle flasque (pour maintenir un stock) ou même en plaque (p24,p12,p6) tu dois procéder de la facon suivante :
- Elimination du milieu de culture
- 1 Rincage PBS(1X)
- ensuite tu procede au "décollement" de tes cellules, en utilisant de la trypsine et/ou de l'EDTA. D'une manière générale, l'EDTA est un traitement plus "doux" pour les cellules. Tu laisse les cellules 1-2minutes à 37°C.
- Tu reprends tes cellules dans du milieu de culture (le SVF va permettre de stopper l'action de la trypsine ou de l'EDTA).
- Tu déposes le volume désiré dans une nouvelle flasque (F25, 75 ou 175) pour passer les cellules, ou bien tu les mets en plaque si tu veux les utiliser pour une manip.


Ensuite, pour l'histoire des virus, et des bactéries, je ne comprends pas bien ce que tu fais. Il existe plusieurs Kit quiagène, du coup on ne peut pas te dire exactement ce que tu fais. Si tu nous donne le nom du kit ce sera plus simple.
Fais tu de la transfection de tes cellules ?

Bref, c'est un peu compliqué de te répondre avec le peu d'infos que tu nous donnes, après peut-être que d'autres personnes trouveront ce que tu veux dire, mais perso comme ca.... j'en doute.

Bon courage !

BenJ

[invite22f28294]

Merci, effectivement je me souvient de l'étuve est à 37°C et des 5% de CO2. J'ai tout compris maintenant. Je vais recopier le nom du kit quiagen et demander ce qu'il fait (en espérant qu'il ait le temps de me repondre lol). Dès que j'ai le nom du kit je le mettrais ici. Je ne sait pas si c'est une transfection, sur le moment j'ai pensait que oui. Il fesait des cultures de bactéries et pas mal de centrifigation. En tout cas vraiment merci