Extraction ADN des queues de souris

[invite9f73924a]

Bonjour à tous !

Etant nouvelle sur le forum et ayant cherchée pendant pas mal de temps sur internet, je m'en remet à vous ...

J'ai mis au point au laboratoire le génotypage d'un type de souris. Mais pour ce faire, j'ai dû extraire l'ADN des queues de souris et je me suis servie du tampon MGB qui contient du Tris, de l'ammonium sulfate et du MgCl2 + ajout de béta mercapto et de triton ...

Pour le MgCl2 je suppose que c'est pour activer la protéinase K dont je me sers un peu plus tard dans le protocole, le béta mercapto et le triton pour permettre la lyse des tissus difficiles mais alors le MGB je n'ai aucune idée de ce à quoi il sert ...

Si quelqu'un à une réponse, je vous en remercie d'avance,

Cordialement

Clarinetistefaufaule
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[Edelweiss68]

Bonjour,

A vérifier mais je dirais que le sulfate d'ammonium précipite les protéines et les séparent donc de l'ADN. Le Tris maintient un pH adapté et le MgCl₂ protège l'ADN (interaction entre charges - et +) de sa dégradation par les DNAses.

[piwi]

Vous extrayez l'ADN des queues de souris avant de les passer à la PK? Ca me semble vraiment curieux.

Cordialement,
piwi

[invite9f73924a]

Je vous envoie le protocole comme je le pratique :
- Préparation du MGB 10X
670mM Tris pH8,8 + 166mM ammonium sulfate + 65mM MgCl2
- préparation du mix MGB 1X
8,85 eau déminéralisée + 1mL 10X MGB + 100µL Bmercapto + 50µL Triton
- ajout de 200µL de mix MGB 1X dans chaque échantillon ; faire bouillir 10 minutes à 95°C
- mettre a T° ambiante et ajouter 10µL de 10mg/mL de protéinase K
- Incuber à 55°C pdt 1h, vortex 30s
- bouillir 10 minutes à 95°C
- centrifugation 14 000G;5min collecter surnageants dans des barrettes de PCR

Ensuite on passe à la PCR et l'électrophorèse ... et c'est pareil, je me pose la question : comment agit la protéinase K ??

Merci encore pour toutes vos réponses

[A voir en vidéo sur Futura]

[Edelweiss68]

Action de la protéinase K

[invite9f73924a]

oa super =) merci beaucoup je ne sais pas comment vous remercier !!

[Edelweiss68]

De rien !

[piwi]

La question n'était pas tant comment fonctionne la PK que sa position dans le processus.
Au laboratoire, nous digérions les tissus par la PK (dans un tampon de lyse) avant de procéder à son extraction par le phénol/choloroforme. J'étais surpris de lire qu'ici on propose d'extraire avant de digérer par la PK, cependant, j'ai vu cela dans des expériences de CHIP. J'imagine que l'idée ici est de digérer les protéines nucléaires insolubles, type histones, avant de procéder à l'extraction finale là encore avec quelque chose comme le phénol/chloroforme.

Cordialement,
piwi