Western blot sur Fractions polysomales

[invite02cefc91]

Bonjour à tous !

Je suis à la recherche de personnes ayant de l'expérience dans l'analyse de protéines issues d'un fractionnement sur gradient de sucrose.

Je réalise une gradient de sucrose pour séparer mes polysomes. Je récupère, à l'aide d'un collecteur, des fractions polysomales (750 uL) plus ou moins concentrées en sucre.

Pour chaque fractions, j'extrais soit les ARN totaux soit les protéines. L'extraction des ARN totaux se passent très bien malgré la présence de sucrose, mais l'extraction des protéines ne me donne pas de résultats satisfaisants.

J'ai utilisé différentes méthodes : une extraction au méthanol mais ma révélation d'anticorps n'est vraiment pas jolie du tout, j'ai essayé une extraction au phénol/chlo,même résultat. Je suis passé à une extraction au TCA avec lavage à l'acétone et ici, ma membrane est moins "sale", mais mes bandes ne sont pas encore satisfaisantes.

Quelqu'un aurait-il une solution miracle ? Et je me pose aussi la question de l'efficacité de rendement de ce genre d'extraction où visiblement le sucre ne facilite pas la chose.

Merci de votre aide !
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[invite71f23525]

As-tu regardé des publications où ils effectuent cette démarche? Souvent les articles de la revue "nucleic acid research" font école dans le domaine de la biologie moléculaire, je commencerais par là à ta place.

Il me semble normal qu'avec des extractions utilisant des solvants organiques tu obtiennes un mauvais résultat en western, mais je peux me tromper. S'il reste des traces de solvant, cela peut interférer sur la liaison SDS/protéine.

Pour le reste, je n'ai jamais utilisé l'extraction en gradient de sucrose donc je ne peux pas t'aider.

[invite3c235e37]

Bonsoir, voici une méthode qui permet de séparer les acides nucléiques des protéines, et qui devrait donc fonctionner sur tes fractions. Cependant je ne l'ai jamais tester sur des polysomes...
Es-tu sur d'avoir suffisamment de prot dans chaque fraction? Tu peux peut-etre pooler tes fractions polysomales, mais ca fera des grand volumes...
Si tu essais, ca m'intéresserais de savoir si ca marche.
Bon courage.

[invitec9f0f895]

Salut

Personnellement, j'utilise le TCA sur les fractions de ribosome de levure et ca marche tres bien. Ca permet de concentrer les échantillons et d'en déposer une bonne quantité sur le gel pour la révélation.

Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite02cefc91]

Merci pour ces réponses.

Effectivement, c'est visiblement le TCA qui marche le mieux. Après , je peux aussi avoir des problèmes de quantité de protéines.
J'ai essayé de pooler des fractions, mais tu passes à des extractions dans des falcons de 15 voir 50 mL et là c'est vraiment galère. Ça marche mais tu augmentes par la même occasion ton bruit de fond.

Après niveau quantité, je dépose 400 mg d'échantillons sur un gradient de 11 mL que je divise en 11 fractions. Je reprends mon culot ensuite dans 30 uL et je dépose tout ....