Problème révélation WB

[invitecdbceb89]

Hello,

On a obtenu un résultat "Bizarre" lors de la révélation d'un WesternBlot et j'aurai voulu savoir si quelqu'un avait une idée d'explication plausible - c'est juste de la curiosité .

(On utilise la technique HRP couplée a Ac IIaire / Luminol et film sensible à la lumière )

On a découpé notre membrane en 3 afin de chercher 3 protéines différentes.

Lors qu'on fait la révélation/fixation sur un premier film , après 1 min d'exposition on obtient bien des bandes correspondant aux 3 la protéines recherchées . Cependant si juste 1 min après on réexpose un nouveau film on obtient plus rien pour l'une des trois protéine , le signal à totalement disparu.

D'après cela on sait donc que ce n'est pas un problème de substrat puisque pour les deux autres protéines le signal est entier et aussi puissant que pour l'exposition précédente.

De plus la solution d'anticorps primaire déjà diluée avait été utilisée précédemment et congelée plusieurs fois et il n'y avait pas eu de problèmes.
Quant à l'anticorps secondaire, c'est le même pour tout le labo et personne n'a eu de problème avec il me semble ....

(On m'avait dit que cela pourrait venir d'un problème de contamination de boite dans laquelle la membrane a incubée ... mais je n'ai pas d'explication vraiment valable )

si quelqu'un avait une hypothèse ... ^^

mercii
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[invite71f23525]

Pour la seconde révélation, augmentes-tu le temps d'exposition (l'activité HRP décroit au cours du temps...)? La bande qui disparait, comment se situe-t-elle par rapport aux deux autres bandes (beaucoup moins intense, plus intense, équivalente,...)?

[invitecdbceb89]

Oui on est passé à 5 min d'expo pour la deuxième . Et oui evidemment la bande était beaucoup plus faible que les deux autres et irrégulière selon les échantillons ( ce qui nous ennui puisqu'il s'agit du controle alpha-actine... )

Et si c'était l'activité de la HRP les autres échantillons aurait souffert aussi non ?

Merci

[invite71f23525]

Je trouve assez bizarre que l'actine soit si peu intense en WB...Es-tu sûr de regarder la bonne taille? L'anticorps primaire est validé? Je n'approuve pas trop la découpe multiple d'une membrane pour faire plusieurs révélation dessus. Si vous faites une grosse découverte (pourquoi pas?) qui sera publiée dans un grand journal, on peut vous demander les WB entiers. Alors plutôt que de tout refaire, autant se caler dès le début sur le plus haut niveau d'exigence.

D'après ce que tu dis, je ne suis pas plus étonné de la disparition de cette bande lors de la deuxième révélation puisque c'est la moins intense de toutes. L'inverse aurait été surprenant. Là c'est juste que pour voir la bande en question, il faut exposer plus : 10 ou 20 minutes par exemple. 5 minutes pour une bande qui sort faiblement, ce n'est pas énorme et ça ne m'étonne pas que tu ne vois rien puisque entre temps l'activité HRP a décru.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitecdbceb89]

"Je trouve assez bizarre que l'actine soit si peu intense en WB...Es-tu sûr de regarder la bonne taille?

Oui moi aussi mais c'est pas le probème là ... Et pour la taille oui quand même ...
Je pense bien que l'anticorps à été validé puisque c'est celui qui est utilisé par tout le labo ...


La découpe de la membrane reste mon problème et dans ce cas c'est loin d'être pour une publi puisqu'il s'agit des tout-premiers résultats pour " donner une idée "... bref .

Evidement je ne trouve cela pas surprenant non plus , je cherche juste une explication au fait qu'une bande ait disparu alors que les deux autres sont totalement intactes ...
euh , si on avait exposé 10min je pense que ca aurait saturé pour les autres bandes ..

et ,
L'activité n'aurait pas décru pour les 3 en même temps dans ce cas là??

[invite71f23525]

Sans avoir les images sous les yeux, les interprétations que nous pouvons faire de ton problème sont approximatives. Selon les niveaux d'intensité, les comportements des bandes peuvent pas mal différer, je ne peux pas aller plus loin dans les suppositions.