puces à ADN

[invite3487261a]

bonjour cher internautes,

je présente mon travail de fin d'étude sur l'utilisation des cellules souches embryonnaires humaines pour évaluer l'embryotoxicité des substances chimiques sans avoir recourt à l’expérimentation animale.

j'introduis l'utilisation des puces à ADN qui permettent de comparer les profils d'expression des ARNm de 2 cultures cellulaires (témoin et soumis à un toxique) mais je ne comprends pas bien la première étape de la formation d'une puce à ADN!!

J'ai cru comprendre que l'on doit tout d'abord fixer sur la lame de la puce des fragments d'ADN des gènes d'interets (mais je ne comprends pas bien comment on fait!! doit-on connaitre le génome de la cellule pour pouvoir ainsi sélectionner les gènes recherchés?)

ensuite on cultive nos cellules dans les conditions voulu, on extrait les ARNm qu'on rétro-transcrit en ADNc. Puis on marque les bases de ces ADNc avec des fluorochromes (rouge ou vert). On mélange les deux échantillons d'ADNc marqués puis on les verse sur notre puce... La oû l'on à préalablement fixé l'ADN du gène d’intérêt??? c'est ça??
Y à t-il un moyen qui permettrait d'utiliser ces micropuces sans connaitre le génome de la cellule? Et qui permettrait alors de détecter des nouveaux gènes impliqués dans la toxicité embryonnaire...

merci par avance
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[invite4ff9937a]

Salut

Les puces sont fabriquées et vendues par certaines boites, jamais tu n'auras à les faire toi même... Sa requière une haute technologie...

En gros on synthétise directement sur la lame une sonde simple brin correspondant à un gène spécifiques, sachant qu'il y'a environs 20 000 gènes chez l'homme tu auras au minimum (en schématisant) 20 000 petits carrés sur la lame avec chacun une sonde spécifique du gène donné. En vérité tu as plusieurs sondes pour chaque gènes donc encore plus de "petit carré"

Et pour faire cela tu vois bien que tu dois connaitre le génome de l'espèce étudié mais sa fait une paire d'année maintenant que le génome humain est connu

cordialement

[invite02e16773]

doit-on connaitre le génome de la cellule pour pouvoir ainsi sélectionner les gènes recherchés?

Ca dépend des puces que tu utilises.

Tu peux très bien utiliser des puces fabriquées à partir de banque d'ADN génomique, ou de banque d'ADNc d'un tissu donné.
Chez les organismes modèles, ça ne se fait plus vraiment maintenant qu'il existe des puces hautement résolutives qui couvrent l'ensemble du génome.

Mais dans le cas d'une espèce bizarre non séquencée ... Y'a pas trop le choix, il faut bien fabriquer une puce à partir de ce que l'on a (banque d'ADNc, ou d'ADN génomique, ...).
Et donc par conséquent, tu ne risques pas de détecter ce qui n'est pas sur ta puce
Et dans ce cas, il faut que tu t'adresses à une plateforme "maison" capable de te fabriquer ta puce, qui n'existera pas préalablement dans le commerce.

Mais bon, c'est pas du tout ton cas vu que tu es chez l'homme !

Du coup, je comprends pas bien ta question :

Y à t-il un moyen qui permettrait d'utiliser ces micropuces sans connaitre le génome de la cellule? Et qui permettrait alors de détecter des nouveaux gènes impliqués dans la toxicité embryonnaire...

Sur tes puces 2 canaux, je suppose que tu as "tous" les gènes humains.
Donc, tu devrais pouvoir détecter de nouveaux gènes différentiellement exprimés dans tes deux conditions, donc ayant potentiellement un rôle dans la réponse à la toxicité embryonnaire...

La question, c'est de savoir ce qu'il signifie, le "tous".
La boîte a qui tu as demandé la puce y a spoté de quoi détecter l'ensemble des gènes humains (y compris les ARNs non codant, je pense, mais vérifie) annotés.

Donc tu ne détecteras pas ce qui n'est pas encore annoté et qui pourrait avoir un rôle.

D'où le fait que les puces à ADN vont progressivement être remplacées par le séquençage massif des ARNs (RNA seq), où là tu t'affranchies de ce problème et peut détecter "tout" (= des choses beaucoup plus faiblement exprimées, et qui jusqu'à présent n'étaient pas annotées).

Mais pour l'heure, les puces permettent quand même de répondre à pas mal de questions...
A quoi bon dépenser plein d'argent (RNA seq = très cher) et de temps pour détecter des centaines d'ARNs de quelques pb dont on ne sait absolument rien, alors que de "simples" puces donnent déjà des listes de gènes candidats non caractérisés longues comme le bras ?

ensuite on cultive nos cellules dans les conditions voulu, on extrait les ARNm qu'on rétro-transcrit en ADNc. Puis on marque les bases de ces ADNc avec des fluorochromes (rouge ou vert). On mélange les deux échantillons d'ADNc marqués puis on les verse sur notre puce... La oû l'on à préalablement fixé l'ADN du gène d’intérêt??? c'est ça??

C'est ça, sauf pour la partie en gras, tu l'auras compris après ce que j'ai écrit : on a fixé l'ADN qu'on voulait...
Dans ton cas, l'ensemble du génome (je pense, vérifie ! ^^), avec une certaine résolution, très variable selon le type de puce.