ARN antisens à partir d'un fragment de gène

[invitedcfa2657]

Bonsoir,

Je suis en pleine révision pour un examen de biologie moléculaire et une question sur la théorie me turlupine, je suis tombé dessus par hasard et j’y réfléchis depuis un moment. J’aurai aimé avoir votre avis sur le raisonnement:

Comment faire une sonde ARN anti sens à partir d’un fragment de gène ?

J’ai deux idées:
1) on fait une sonde ARN sens via une transcription localisée sur le fragment, à partir du brin matriciel non codant mais transcrit (pour peu qu’on arrive à limiter la transcription au fragment et pas au delà en aval)
2) on utilise une ARN polymérase sur la sonde sens néosynthétisée, en présence de dATP, dGTP, dUTP et dCTP* radioactif, pour synthétiser un brin anti sens complémentaire au brin arn sens, donc identique au brin non codant d’ADN (mais avec U au lieu de T), donc complémentaire au fragment ADN (et le brin anti sens sera marqué radioactivement via dCTP*)

ou

1) on séquence le fragment ADN du gène via Sanger (le fragment ne doit pas être trop grand pour dire d’invalider l’utilisation de cette technique)
2) on a ainsi une séquence ADN en clair. On va faire dans une chambre de synthèse un oligonucléotide d'ARN nucléotide par nucléotide qui sera complémentaire à cette séquence, donc un brin anti sens (complémentaire à l'ARN sens qui lui est strictement identique à la séquence d'ADN, avec U au lieu de T évidemment)

Est-ce correct comme raisonnement ?

NB: le séquençage de Sanger peut-il être pratiqué sur de l’ARN ? J’aurai tendance à dire oui, pour peu qu’on utilise du dUTP/ddUTP au lieu de dTTP/ddTTP. Auquel cas on peut appliquer la deuxième solution sur base de la séquence de l’ARN sens ?

+ autre question:

Par recherche dans les banques de données sur internet vous avez trouvé la séquence du gène de l'hormone de croissance humaine. A quel endroit du gène choisiriez-vous la séquence de votre sonde d'ADN pour cribler la banque que vous venez de construire et trouver l'ADN complémentaire codant pour l'hormone de croissance?

Dans un exon du gène: l'ADN complémentaire provient d'une rétrotranscription d'un ARNm, donc épissé, donc si on veut faire une sonde dans le gène, il faut que celle-ci soit au niveau d'un exon, si elle tombe dans un intron elle pourrait ne pas se retrouver dans l'ARNm et donc dans l'ADNc > on trouverait rien dans la banque. Juste ou pas ?

Merci d’avance et bonne soirée !
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[invitedcfa2657]

Correction:
on utilise une ARN polymérase sur la sonde sens néosynthétisée, en présence de ATP, GTP, UTP et CTP* radioactif

Pour le Sanger d'ARN, oubliez, apparemment on ne peut pas (dixit mon professeur, ARN trop fragile pour la manip + pas d'amorces pour une ARN polymérase, donc problème de ciblage)

[invitedcfa2657]

Rebonsoir,

Désolé de poster 3 fois de suite, mais faute de pouvoir éditer, je tiens au courant de la suite: j'ai trouvé, c'était dans mon cours ^^

Utilisations du promoteur et de la RNA polymérase du phage T7, T3, SP6

Ces phages ont des ARN polymérases très efficaces et des promoteurs très simples et petits. Ils vont permettre de fabriquer in vitro de l’ARN.
Un plasmide vecteur de clonage créé artificiellement peut avoir autour de son MCS (Multiple Cloning Site) deux promoteurs différents (phages T7 et SP6), ce qui peut donner lieu à deux ARN (un sens et un antisens), selon que le démarrage de la transcription se fasse à un promoteur ou à l’autre. Ce plasmide sera utile car fournisseur de sondes pour des Northern blot (Southern blot pour de l’ARN et non plus de l’ADN) ou de la transcription traduction artificielle comme expliqué ci-dessus.

Voilà, problème résolu pour la première citation ^^
Néanmoins, la question de la 2e citation tient toujours ^^
Merci d'avance

[invitec9f0f895]

Salut

Oui ta deuxieme reponse est correcte.

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitedcfa2657]

Ok nickel, merci à vous et bonne soirée