Bonjour,
Je souhaiterai obtenir un fragment d'ADN double brin à partir de 3 produits PCR.
J'ai 3 produits PCR : 1 de 450pb - 1 autre de 500pb et 1 dernier de 800pb.
J'aimerai obtenir un seul et même fragment à partir de ces 3 produits. Les coller ensemble si je puis dire...
J'ai déjà réalisé la technique par PCR selon la stratégie mise en fichier attaché mais je n'obtiens qu'un fragment à 500pb au lieu des 1750pb attendues
Comment puis-je faire ?
merci bcp pour vos réponses
tu veux les mettre dans un ordre précis ? La meilleure solution je pense est d'utiliser des amorces contenant des sites de restriction et de faire une ligation ensuite.
oui je veux les mettre dans un ordre précis.
C'est vrai que je n'avais pas pensé aux sites de restriction. qu'est ce qui est le mieux ligation bouts francs ou bouts cohésifs ensuite ?
cohésifs, tu peux mettre un site de restriction différent et unique a chaque bout de ton produit de PCR (avec les amorces), ensuite du digères et tu fais la ligation... COmme ça c'est orienté
mais j'ai un doute : je me demandais si je pouvais liguer mes trois fragments en même temps sans passer par une étape de clonage, c'est à dire que la ligation ne se fasse pas par un vecteur ?
La methode que tu as decrite est la meilleure pour ce genre de truc. Utiliser des sites de restriction va compliquer la chose. Es tu sur d'avoir bien purifie tes premiers produits PCR histoire de ne pas ramener des amorces dans ton 2eme tours de PCR?
Si tu amplifies quelque chose a 500, ca signifie que un de tes fragments (celui a 500) etait mal purifie.
A+
oui gorben a raison, quand j'avais répondu l'image n'était pas encore validée
oui j'ai purifié les 3 produits PCR par extraction sur gel, les ratios A260/A280 sont à 1.8 ou 1.9 et ceux A260/A230 à 0.5 / 0.9 ou 0.3.
je mets les 3 à la même concentration (30ng) et je fais une PCR avec l'amorce Fwd du début du gène et l'amorce rev de la fin de gène.
concernant le programme PCR, j'ai fait une 1ère étape sans les amorces:
94°C 30s
72°C 5mn
c'est pour que les fragments s'hybrident et que la taq fasse l'élongation.
Ensuite j'ai rajouté les amorces et j'ai fait une PCR classique en 40 cycles:
94°C 30s
58°C 30s
72°C 3mn
mais je n'obtiens pas le fragment à 2200pb attendu, j'ai toujours l'amplification d'un amplicon de 500pb. voir photo de gel
Tes fragments s'overlapent beaucoup?
Renaud
ils se chevauchent d'une vingtaine de pb : la taille d'une amorce.
T'as pas besoin d'une DNA ligase?
Renaud
Perso je les aurais fait chevaucher un peu plus.Envoyé par vivelabm...
J'imagine que ton fragment de 500 n'est pas au milieu. Si c'est le cas tu as 2 possibilites :
- mauvaise purif, il te reste des oligos
- hybridation non spe du second primer dans le fragment a 500 ( a la fin) ou au debut du fragment a 800 (si c'est celui du milieu).
Le plus simple c'est de repurifier une autre fois, puis si ca ne marche pas de commander d'autres oligos pour ta 2eme PCR.
Je ne ferais pas 94C --> 75C pour l'hybridation.
Je mettrais mes tubes a chauffer dans un container (a 95C, mini 1/2L) puis je mettrais le container dans la chambre froide toute la nuit (ou jusqu'a ce que le container soit froid). Ensuite tu peux faire un round a 75C pour la premiere elongation. Un refroidissement lent va permettre une bien meilleure hybridation des fragments, surtout si ceux ci ne se chevauchent que de 20pb. D'ailleurs tes primers de 20 pb tu hybrides a 58C mais pas tes fragments de meme taille, bizarre non?
A+
C'était juste pour souligner le fait qu'il manquait deux flèches rouges sur ton image.
Sinon 20 nt suffisent en général j'ai quand même vérifié, mais comme la fait remarqué Gorben il manque pour moi une phase d'appariement au début.
http://en.wikipedia.org/wiki/Polymer...cling_assembly
Y'a des liens vers des publis à la fin peut être que tu trouveras des réponses.
Renaud
bon alors je vais m'inspirer de ce que Gorben et wolfgangouille m'ont dit. je vais persévérer dans ma statégie par PCR.
une PCR avec 55 cycles avec mes 3 produits PCR sans les amorces pour faire la cassette entière :
94°C 30s / 58°C 30s / 72°C 3mn (car il faut que j'obtienne un fgt de 2.2kb)
Ensuite je vais faire une 2ème PCR en diluant le produit PCR 1 10-20-30-40-50 fois et en ajoutant les amorces. je vais bien finir par y arriver...
merci à tous, je vous tiens au courant et d'ici là si vous avez d'autres idées ou avis n'hésitez pas
Morgane
A mon avis tu pars dans la mauvaise direction. Ton probleme ressemble plus a une contamination qu'a une mauvaise amplification. Pour moi le probleme vient de annealing de tes produits PCR. Si tu n'a pas a la base un bon pool de produit a amplifier, la taq va amplifier tout et n'importe quoi (surtout n'importe quoi d'ailleurs).bon alors je vais m'inspirer de ce que Gorben et wolfgangouille m'ont dit. je vais persévérer dans ma statégie par PCR.
une PCR avec 55 cycles avec mes 3 produits PCR sans les amorces pour faire la cassette entière :
94°C 30s / 58°C 30s / 72°C 3mn (car il faut que j'obtienne un fgt de 2.2kb)
Ensuite je vais faire une 2ème PCR en diluant le produit PCR 1 10-20-30-40-50 fois et en ajoutant les amorces. je vais bien finir par y arriver...
merci à tous, je vous tiens au courant et d'ici là si vous avez d'autres idées ou avis n'hésitez pas
Morgane
Faire une deuxieme PCR sur le produit apres 55 cycles ne va pas t'aider si tu as du non specifique.
A+
Bon alors je repars de zéro
mais bon tu as raison Gorben, autant être sûre de ce que j'apporte comme pool d'ADN.
Je refais mes trois PCR et je les purifie en espérant avoir du coup une meilleure purif...
j'espère que c'est vraiment cela le problème...
Je vous tiens au courant !!!
