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Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR




  1. #1
    vivelabm...

    Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    Bonjour,
    Je souhaiterai obtenir un fragment d'ADN double brin à partir de 3 produits PCR.
    J'ai 3 produits PCR : 1 de 450pb - 1 autre de 500pb et 1 dernier de 800pb.
    J'aimerai obtenir un seul et même fragment à partir de ces 3 produits. Les coller ensemble si je puis dire...
    J'ai déjà réalisé la technique par PCR selon la stratégie mise en fichier attaché mais je n'obtiens qu'un fragment à 500pb au lieu des 1750pb attendues
    Comment puis-je faire ?
    merci bcp pour vos réponses

    -----

    Images attachées Images attachées

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  3. #2
    Flyingbike

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    tu veux les mettre dans un ordre précis ? La meilleure solution je pense est d'utiliser des amorces contenant des sites de restriction et de faire une ligation ensuite.

  4. #3
    vivelabm...

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    oui je veux les mettre dans un ordre précis.
    C'est vrai que je n'avais pas pensé aux sites de restriction. qu'est ce qui est le mieux ligation bouts francs ou bouts cohésifs ensuite ?


  5. #4
    Flyingbike

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    cohésifs, tu peux mettre un site de restriction différent et unique a chaque bout de ton produit de PCR (avec les amorces), ensuite du digères et tu fais la ligation... COmme ça c'est orienté

  6. #5
    vivelabm...

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    mais j'ai un doute : je me demandais si je pouvais liguer mes trois fragments en même temps sans passer par une étape de clonage, c'est à dire que la ligation ne se fasse pas par un vecteur ?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    gorben

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    La methode que tu as decrite est la meilleure pour ce genre de truc. Utiliser des sites de restriction va compliquer la chose. Es tu sur d'avoir bien purifie tes premiers produits PCR histoire de ne pas ramener des amorces dans ton 2eme tours de PCR?

    Si tu amplifies quelque chose a 500, ca signifie que un de tes fragments (celui a 500) etait mal purifie.

    A+

  9. #7
    Flyingbike

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    oui gorben a raison, quand j'avais répondu l'image n'était pas encore validée

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  11. #8
    vivelabm...

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    oui j'ai purifié les 3 produits PCR par extraction sur gel, les ratios A260/A280 sont à 1.8 ou 1.9 et ceux A260/A230 à 0.5 / 0.9 ou 0.3.
    je mets les 3 à la même concentration (30ng) et je fais une PCR avec l'amorce Fwd du début du gène et l'amorce rev de la fin de gène.
    concernant le programme PCR, j'ai fait une 1ère étape sans les amorces:
    94°C 30s
    72°C 5mn
    c'est pour que les fragments s'hybrident et que la taq fasse l'élongation.
    Ensuite j'ai rajouté les amorces et j'ai fait une PCR classique en 40 cycles:
    94°C 30s
    58°C 30s
    72°C 3mn
    mais je n'obtiens pas le fragment à 2200pb attendu, j'ai toujours l'amplification d'un amplicon de 500pb. voir photo de gel

  12. #9
    wolfgangouille

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    Tes fragments s'overlapent beaucoup?
    Renaud

  13. #10
    vivelabm...

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    ils se chevauchent d'une vingtaine de pb : la taille d'une amorce.

  14. #11
    wolfgangouille

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    T'as pas besoin d'une DNA ligase?
    Renaud

  15. #12
    gorben

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    Citation Envoyé par vivelabm... Voir le message
    ils se chevauchent d'une vingtaine de pb : la taille d'une amorce.
    Perso je les aurais fait chevaucher un peu plus.
    J'imagine que ton fragment de 500 n'est pas au milieu. Si c'est le cas tu as 2 possibilites :
    - mauvaise purif, il te reste des oligos
    - hybridation non spe du second primer dans le fragment a 500 ( a la fin) ou au debut du fragment a 800 (si c'est celui du milieu).

    Le plus simple c'est de repurifier une autre fois, puis si ca ne marche pas de commander d'autres oligos pour ta 2eme PCR.

    Je ne ferais pas 94C --> 75C pour l'hybridation.
    Je mettrais mes tubes a chauffer dans un container (a 95C, mini 1/2L) puis je mettrais le container dans la chambre froide toute la nuit (ou jusqu'a ce que le container soit froid). Ensuite tu peux faire un round a 75C pour la premiere elongation. Un refroidissement lent va permettre une bien meilleure hybridation des fragments, surtout si ceux ci ne se chevauchent que de 20pb. D'ailleurs tes primers de 20 pb tu hybrides a 58C mais pas tes fragments de meme taille, bizarre non?

    A+

  16. #13
    wolfgangouille

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    Citation Envoyé par wolfgangouille Voir le message
    T'as pas besoin d'une DNA ligase?
    C'était juste pour souligner le fait qu'il manquait deux flèches rouges sur ton image.

    Sinon 20 nt suffisent en général j'ai quand même vérifié, mais comme la fait remarqué Gorben il manque pour moi une phase d'appariement au début.

    http://en.wikipedia.org/wiki/Polymer...cling_assembly
    Y'a des liens vers des publis à la fin peut être que tu trouveras des réponses.
    Renaud

  17. #14
    vivelabm...

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    bon alors je vais m'inspirer de ce que Gorben et wolfgangouille m'ont dit. je vais persévérer dans ma statégie par PCR.
    une PCR avec 55 cycles avec mes 3 produits PCR sans les amorces pour faire la cassette entière :
    94°C 30s / 58°C 30s / 72°C 3mn (car il faut que j'obtienne un fgt de 2.2kb)
    Ensuite je vais faire une 2ème PCR en diluant le produit PCR 1 10-20-30-40-50 fois et en ajoutant les amorces. je vais bien finir par y arriver...
    merci à tous, je vous tiens au courant et d'ici là si vous avez d'autres idées ou avis n'hésitez pas
    Morgane

  18. #15
    gorben

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    Citation Envoyé par vivelabm... Voir le message
    bon alors je vais m'inspirer de ce que Gorben et wolfgangouille m'ont dit. je vais persévérer dans ma statégie par PCR.
    une PCR avec 55 cycles avec mes 3 produits PCR sans les amorces pour faire la cassette entière :
    94°C 30s / 58°C 30s / 72°C 3mn (car il faut que j'obtienne un fgt de 2.2kb)
    Ensuite je vais faire une 2ème PCR en diluant le produit PCR 1 10-20-30-40-50 fois et en ajoutant les amorces. je vais bien finir par y arriver...
    merci à tous, je vous tiens au courant et d'ici là si vous avez d'autres idées ou avis n'hésitez pas
    Morgane
    A mon avis tu pars dans la mauvaise direction. Ton probleme ressemble plus a une contamination qu'a une mauvaise amplification. Pour moi le probleme vient de annealing de tes produits PCR. Si tu n'a pas a la base un bon pool de produit a amplifier, la taq va amplifier tout et n'importe quoi (surtout n'importe quoi d'ailleurs).

    Faire une deuxieme PCR sur le produit apres 55 cycles ne va pas t'aider si tu as du non specifique.

    A+

  19. #16
    vivelabm...

    Re : Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

    Bon alors je repars de zéro
    mais bon tu as raison Gorben, autant être sûre de ce que j'apporte comme pool d'ADN.
    Je refais mes trois PCR et je les purifie en espérant avoir du coup une meilleure purif...
    j'espère que c'est vraiment cela le problème...
    Je vous tiens au courant !!!

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