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Construction Banque ADNc



  1. #1
    Medenor

    Construction Banque ADNc

    Bonsoir,

    Je suis en pleine révision pour un examen de biologie moléculaire et j'ai quelques questions sur les Banques ADNc:

    Donc on fait une rétrotranscription d'un ARNm, on obtient un ADNc. On veut un ADNc bicaténaire, donc il faut éliminer l'ARNm et le remplacer.

    On peut faire un traitement au NaOH, qui détruit l'ARNm et on utilise une ADN polymérase pour avoir le 2e brin d'ADNc, via l’extrémité en épingle à cheveux du premier brin d'ADNc.

    On peut aussi utiliser la RNAse H pour casser l'ARN. La RNase H induit bien des cassures avec une extrêmité 3'OH et 5'P ? Ou bien détruit-elle la quasi totalité de l'ARN en ne laissant que quelques bouts en guise d'amorces (un peu à la manière d'un traitement au NaOH) ?

    Une ADN polymérase I vient ensuite remplacer l'ARN par de l'ADN, à partir des cassures. Correct ? Ou bien dans le cas où la RNAse a détruit la quasi totalité comme dit ci-dessus, la Pol I part des amorces vu qu'il n'y a pas de cassures.

    Cette ADN polymérase I, c'est un Fragment de Klenow ou la véritable ADN Pol I ?

    Car d'après ce que j'ai compris:

    ADN pol I : polymérisation 3' -> 5' ; exonucléase 3' -> 5' ; exonucléase 5' -> 3'
    Fragment de Klenow: ADN pol I modifiée (par digestion) qui a perdu la fonction exonucléase 5' -> 3'

    Normalement c'est le fragment de Klenow qu'on utilise généralement sous le terme ADN pol I, non ? L'ADN polymérase I est une enzyme qui d'une part polymérise l'ADN à partir d'une matrice mais qui d'autre part coupe l'ADN grâce à son activité exonucléasique 5'-3'. Du coup elle coupe ce qu'elle synthétise, ce qui n'est pas top => on élimine la partie de la protéine permettant l'activité exonucléasique 5'-3' => on ne conserve que l'activité de polymérisation.

    Pol I normalement on l'utilise pour Nick Translation (agit sur la brèche, ca synthétise sur le côté 3' de la brèche et ca désassemble sur le côté 5' de la brèche) si je ne me trompe pas, ca remplace purement et simplement de l'ADN ou de l'ARN par une copie identique (à ceci près que dans Nick translation on peut ajouter des marqueurs radioactifs).

    Donc à ce moment là, si pour ce que je disais avec la RNAse, on a des brèches, ca serait une Pol I, mais si c'est à la manière du NaOH, c'est Klenow. Non ?

    Je vous avoue être embrouillé sur la question car on nous a dit que la RNAse agit par à-coups (là où la méthode chimique à la soude est agressive et détruit tout l’ARN d’un coup) et induit une série de cassures dans l’ARN, mais si c'est à la manière du NaOH, une ADN Pol I véritable (donc pas Klenow) ne conviendrait pas. Ou je me trompe ?

    Merci d'avance

    -----

    Dernière modification par Medenor ; 09/06/2011 à 18h52.

  2. #2
    Medenor

    Re : Construction Banque ADNc

    Ok j'ai la réponse via mon professeur:

    Si on attaque l'ARN par NaOH: fragment de Klenow (polymérase 5’→ 3’ via le côté 5' en épingle)
    Si on attaque l'ARN par RNase H (qui digère une bonne partie et laisse quelques morceaux qui font office d'amorce): Polymérase I (polymérase 5’→ 3’ et exonucléase 5’→ 3’)

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