aide sur le séquençage de l'ADN

[arezki08]

bonjours, j'ai fait une pcr pour u virus de la vigne et pour faire un sequensage je doit d'abord faire un clonnage mais je ne ttrouve pas ou le commander et j'ai peur de me tromper dans la commande. est ce que qlq un peut m'orienté
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[jmbowie]

bonjours, j'ai fait une pcr pour u virus de la vigne et pour faire un sequensage je doit d'abord faire un clonnage mais je ne ttrouve pas ou le commander et j'ai peur de me tromper dans la commande. est ce que qlq un peut m'orienté

Bonjour,

Tu travailles sur un virus et tu veux le séquencer et pour cela tu veux le cloner entièrement ? certains fragments ? Par ailleurs que veux-tu commander ? Le séquençage ?
Merci de ces précisions. A bientôt

[arezki08]

je veut clonner une partie d'un gene de ce virus (GLRaV-3), une partie du gene hsp70h, j'ai le produit pcr, il me rreste seulement a sequençé le prduit pcr, est pour cela il faut que je le clonne et que je l'envoi a un laboratoire

[jmbowie]

je veut clonner une partie d'un gene de ce virus (GLRaV-3), une partie du gene hsp70h, j'ai le produit pcr, il me rreste seulement a sequençé le prduit pcr, est pour cela il faut que je le clonne et que je l'envoi a un laboratoire

D'accord je comprend mieux.
Tu peux le cloner dans un vecteur à bouts francs tels que le pGemT-Easy puis envoyer à séquencer l'ADN plasmidique de quelques clones recombinants (vérifiés par PCR) accompagné d'une préparation d'un oligo qui s'hybride sur le vecteur. Le tout selon les conditions requises par le prestataire de services

[A voir en vidéo sur Futura]

[arezki08]

donc je doit commander le vecteur PGemt-easy pour faire le clonnage ?

[jmbowie]

donc je doit commander le vecteur PGemt-easy pour faire le clonnage ?

Pas nécessairement si vous avez déjà un vecteur ayant des sites uniques de restrictions compatibles avec ceux éventuellement présents au bout de vos amorces.

[invitec718404f]

Je ne comprends pas, si tu as un produit de PCR tu peux faire séquencer le produit de PCR directement, pourquoi t'embêter à cloner ça?

[inviteabac6f11]

Je ne comprends pas, si tu as un produit de PCR tu peux faire séquencer le produit de PCR directement, pourquoi t'embêter à cloner ça?

J'allais le dire...
En envoyant les amorces avec lesquelles vous avez fait la PCR (si ce ne sont pas des amorces universelles) au prestataire qui fait le séquençage, vous pourriez vous épargnez le clonage...
A moins qu'il y ait une raison que nous ignorons

[jmbowie]

J'allais le dire...
En envoyant les amorces avec lesquelles vous avez fait la PCR (si ce ne sont pas des amorces universelles) au prestataire qui fait le séquençage, vous pourriez vous épargnez le clonage...
A moins qu'il y ait une raison que nous ignorons

Apparemment on lui a demandé de cloner, soit pour séquencer plus proprement, soit pour faire une manip derrière

[invitec718404f]

Cloner ne permet pas de sequencer mieux qu'avec une PCR.

[jmbowie]

Cloner ne permet pas de sequencer mieux qu'avec une PCR.

Cela permet de déterminer la séquence complète d'un seul produit de PCR unique tandis que dans amplifiat tu peux avoir un mélange de produits et pas forcément le voir sur ton gel de séquences (ou des fois tu vois le double pic)

[invitec718404f]

Si ton amplification n'est pas très spécifique alors, moi je fais ça en routine et je n'ai jamais eu de souci...

[jmbowie]

Si ton amplification n'est pas très spécifique alors, moi je fais ça en routine et je n'ai jamais eu de souci...

Non il peut y avoir des erreurs d'amplifications qui génèrent des variations de quelques bases dedans.

[inviteabac6f11]

Cloner puis séquencer est aussi préalable à l'expression du gène dans un système hétérologue... Du coup, on comprend le pourquoi du clonage avant le séquençage (encore faut-il qu'il s'agisse d'un vecteur d'expression si c'est vraiment là, le but de la manoeuvre).

Mais vous n'avez pas d'aide autour de vous ? Un maître de stage ? Un tuteur ? Un collègue plus expérimenté ?
D'autant que chaque labo a ses petites habitudes quant au clonage et aux vecteurs utilisés...

[invitec718404f]

Non il peut y avoir des erreurs d'amplifications qui génèrent des variations de quelques bases dedans.

Si tu as des erreurs par PCR elles seront toujours là après clonage...

Il ne parle pas d'expression, d'ou ma question pourquoi s'embêter à cloner?

[arezki08]

je vous remercie énormement pour tous vos conseille

[invitec718404f]

De rien, tu en es oú avec ton prObleme?

[invitedeb0206a]

Le but du clonage ne pourrait pas tout simplement être une manière de multiplier encore la quantité "d'amplicon" en vue du séquençage? Plus il y a de matrice plus le séquençage sera précis non?

[invitec718404f]

Pas forcemment mais il y a quantité minimale pour que ça fonctionne. Mais niveau amplification D'adn la PCR reste le plus simple, rapide, et bon marché, d'où nos questions...