Régulation expression d'un gène

[invite7ed79add]

Bonjour ,

j'ai problème pour résoudre l'exercice d'un annal. Pouvez-vous m'aidez s'il vous plait?
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Question 1: On peut voir que l'expression du gène X est régulé. Plusieurs ARNm différents existent. Cela est peut-être dû à un épissage alternatif, promoteur ou terminateur alternatif. De plus, on observe une régulation quantitative des ARNm.

Question 2 : Les ARN de 2,6kb et 4,5kb (sur électrophorèse) contiennent les 4 exons. Celui de 4,5kb contient qqc en plus (un intron de 4,5-2,6=1,9kb). Celui de 1,9 ne contient pas les exons 2 et 3. Cela est surement dû à un épissage alternatif et pas un promoteur ou terminateur alternatif.

Question 3 : On peut donc dire que l'intron 1 n'est pas excisé dans l'ARN de 4,5kb.
Y-a-t-il d'autres hypothèses possibles?
Mais je ne vois pas du tout comment tester l'hypothèse. Quelqu'un pourrait m'éclairer s'il vous plait?
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[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Les exercices se postent dans la rubrique "exercices en biologie".

LXR pour la modération

[invite7ed79add]

Ah d'accord, au temps pour moi.
Personne pour m'éclairer?

[LXR]

Question 1 : Tu ne parles pas de la tissu-spécificité de l'expression de l'ARNm détecté. En une simple phrase, tu peux dire : "La sonde d'ADNc détecte trois fragments de taille différente exprimés différentiellement suivant le tissu concerné." Les hypothèses peuvent être celles que tu as énoncées mais aussi la détection de gènes partageant une région homologue à celle choisi pour faire la sonde. C'est pourquoi parler directement de la détection de l'ARNm correspondant à l'ADNc et des possibles variations de transcrits est peut-être un peu prématuré en l'état de l'exercice car des biais peuvent s'interposer (détection de régions homologues d'autres gènes). Vu comme la question est posée, je ne suis pas sûr que tu dois pousser ta réponse jusqu'à l'énonciation d'hypothèses (la difficulté perpétuelle de ce genre d'exercice repose beaucoup sur savoir quand s'arrêter : la sur-interprétation est autant pénalisable que la sous-interprétation).

Question 2 : Les différents fragments détectés par la sonde d'ADNc en northern blot dans l'expérience précédente sont donc des variants d'épissage d'un même ARNm (là cette interpétation vient à point nommé, la démonstration est claire). Les exons 1 et 4 sont présents dans tous les variants d'épissage alors que les exons 2 et 3 ne sont pas présents dans le plus petit transcrit spécifique du rein. La somme de la taille de tous les exons ne permet pas de retrouver la taille du fragment le plus grand détecté, ce qui suggère la présence d'une séquence supplémentaire qui est n'est pas présente dans les variants de taille inférieure (attention à ne pas parler directement d'intron car à la base, les sondes ont été faite à partir d'un ADNc de 2,6 kb. A cette étape, on ne peut pas dire que tous les exons ont été identifiés : certains subsistent peut-être dans la forme de 4,5 kb).

Question 3 : L'intron 1 est présent dans le plus grand des fragments uniquement ce qui signifie qu'il est épissé dans les autres variants d'épissage. Ce résultat explique l'incrément de taille observé entre le fragment le plus grand et la somme de la taille de tous les exons dans l'expérience précédente. On peut donc supposer qu'un exon du gène X a été écarté dans l'expérience précédente qui considérait au maximum tous les exons présents dans le fragment de 2,6 kb. Le segment appelé intron 1 est certainement un exon présent uniquement dans le variant le plus grand.

Pour tester cette hypothèse, on fait la même expérience que dans la question 2 sauf qu'on prend l'ADNc de l'ARNm de 4,5 kb : hybridation ADNc avec ADN génomique. A priori, tous les variants ont la même origine qui est le début de l'exon 1. Leur variation se situe après, donc si un schéma doit être fait, l'origine sera la même, c'est la présence ou absence des exons qui les discriminera.


Question 4 : Tous les transcrits sont générés à partir du même point +1.

Question 5 : La séquence mis en évidence par cette expérience est certainement un enhancer puisque sa délétion induit une perte d'activation du promoteur. Les régions proximales d'un promoteur sont riches en séquences régulatrices, on s'attendait donc, par une expérience de délétion, de supprimer une ou plusieurs séquences activatrice du promoteur.
Comment vérifier l'hypothèse d'un enhancer : il est situé entre -242 et -97. On séquence cette région et on la crible contre une banque de séquence consensus de facteurs de trancription (séquences enhancer). Une fois trouvée, on prend la construction entière du promoteur, et on ajoute des mutations ponctuelles dans la séquence enhancer qui l'inactivent spécifiquement. On s'attend à obtenir le même résultat que la délétion entière et non spécifique de la région contenant l'enhancer.

Question 6 : Ils doivent se trouver dans la séquence du pré-ARNm puisque cette régulation tissu-spécifique semble intervenir uniquement au niveau de l'épissage alternatif. On a certainement des sites accepteurs/donneurs d'épissage régulés de manière tissu-spécifique dans le pré-ARNm.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite7ed79add]

Super! Je vous remercie infiniment pour cette correction. Je tiens à dire que ça m'a plus que éclairé pour l'analyse des résultats. Je n'avais aucune correction des annales (on est testé sur notre adaptation en fonction des exercices donnés --')
Bref, merci encore

[invite7ed79add]

Cependant, je ne comprend pas très bien la notion de délétion récurrente dans la question 5. En quoi consiste-t-elle?

[LXR]

Le schéma qui suit le montre : on réalise plusieurs constructions qui sont à chaque fois une délétion de la précédente. Ainsi, on peut arriver à localiser précisément où se trouve la séquence régulatrice (entre -242 et -97 ici puisque c'est lorsque cette région est délétée qu'on a une perte d'activation du promoteur).

[invite7ed79add]

Ah oui c'est bon je vois, merci
Et en général, pour d'autres exercices, si je fais l'hypothèse de promoteur alternatif, quel genre de test permettrait de le vérifier?
Et pour un terminateur alternatif? Certe je peux faire l'hypothèse, mais comment le vérifier? J'en profite pour vous le demander car vous avez l'air d'être à l'aise en bio mol .
Encore merci pour les explications

[LXR]

Le promoteur alternatif est aussi un point +1 alternatif. C'est la manip de la question 4 qui permet de répondre à cette question : l'extension d'amorce.

Pour le terminateur alternatif, on peut faire la même chose, sauf qu'il faudra se placer sur le dernier exon pour être sûr que l'incrément de taille n'est pas carrément un exon supplémentaire. Ensuite, pour vérifier la manip, il faut chercher si aux localisations retrouvées des terminateurs correspondent des sites de polyadénylation. Même si cette séquence ne constitue pas vraiment un terminateur, elle est nécessaire pour la maturation de l'extrémité 3' et permet de renforcer l'hypothèse d'un terminateur.

[LXR]

Erratum : on ne peut pas faire d'extension d'amorce sur la partie 3' étant donné qu'elle se termine par une queue polyA. Le mieux est peut-être de faire un séquençage de la partie 3' qui nous renseignera sur l'origine de l'incrément de taille observé en 3'. Normalement, sur la partie 3' la plus longue, on devrait retrouvé les séquences des différents sites de polyadénylation. A vérifier car je n'ai jamais été confronté à cette situation.

[invite7ed79add]

D'accord je note au cas où...
Et savez-vous ce qu'est le linker scanning et la DNAse protection?
Désolé je pose trop de questions

[LXR]

Je ne connais pas le linker scanning.

Pour la protection à la DNase, cela est souvent utilisé pour définir les zones de l'ADN où se fixent des protéines (facteurs de transcription par exemple). On incube la DNase avec l'ADN à tester. A l'endroit où l'ADN n'est pas été dégradé, on a une protéine fixé à l'ADN, elle protège la zone d'interaction protéine-ADN de l'action de la DNase. Les zones libres (sans aucune protéine fixée) sont dégradées par la DNase. Je ne sais pas si tu connais le footprint génomique : c'est aussi une expérience de protection à la DNase.