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Maxi-prep avec rendement très faible



  1. #1
    montreux_d

    Maxi-prep avec rendement très faible


    ------

    Bonjour à tous,
    Je viens à vous car depuis pas mal de temps je suis confronté à un problème assez embêtant: il se trouve que de nombreuses maxi-prep que j'effectue ont un rendement très faible (masse finale de 40ug). J'ai pu remarquer que je n'obtiens ces rendements que pour des bactéries possédant le plasmide pCDNA3 (indépendemment de l'insert). Je précise que j'ai utilisé les kit macherey et Nagel ainsi que les kit de promega (midi prep) et tous me donnent de tel résultats, je laisse également les cultures se développer durant 24h à 37°C (visuellement les cultures sont bien denses). Je suis le protol à la lettre sans modification de ma part. Auriez vous une idée de comment augmenter le rendement des prep?

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  3. #2
    montreux_d

    Re : Maxi-prep avec rendement très faible

    Encore une petite question en passant: Pour les mini prep j'utilise, depuis que l'on m'a appris cette technique, la méthode suivant: le début est identique au mini-prep de base dans le sens que je resuspend, je lyse puis je neutralise sauf qu'ensuite je fais sans colonne: je centrifuge le tout, récolte uniquement la phase liquide, puis je centrifuge le surnageant après avoir ajouté de l'isopropanol et pour finir j'élimine le surnageant, le rince avec de l'EtOH et enfin je supprime l'ETOH pour resuspendre dans l'eau. Pensez vous que cette technique pose problème pour ensuite utilisé l'ADN dans des transfections calcium phosphate?
    je sais que pour des séquençage cette technique ne fonctionne pas top en raison de trace d'EtOH ou isoprop qui pourrait rester!

  4. #3
    montreux_d

    Re : Maxi-prep avec rendement très faible

    Je m'auo réponds: en fait mon plasmide possède une origine de réplication pbr322 en faisant un plasmide a faible copie dans chaque bactérie. donc je dois suivre les protocoles pour les plasmides low copy, ce que je ne faisais pas!

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