Faire divorcer un couple Ag-Ac

[invite240ac937]

Bonjour.

Je suis en train de mettre au point un protocole expérimental pour tenter de doser une protéine.
Sans trop rentrer dans les détails, il y a certaines contraintes qui me font me tourner vers le design suivant :
Cultiver les cellules dans une plaque multipuits.
Fixer.
Marquer la protéine avec un anticorps primaire.
Marquer la protéine avec un anticorps secondaire marqué avec un fluorophore.

La suite consisterait à "lyser" ce qu'il reste des cellules fixées ; j'entends par là remettre en solution les anticorps marqués de manière à pouvoir faire une lecture fluorimétrique.

J'imagine de décrocher un anticorps de l'antigène auquel il est lié est une mission que seul Mc Gyver peut réussir.
Les options restantes consisteraient :
- soit à digérer les Ac avec de la trypsine pour libérer le fluorophore,
- soit à "bousiller" les cellules fixées de manière à libérer un fragment protéique couplé aux anticorps primaires et secondaires.

Avez-vous déjà vu un protocole du genre ?
Mon idée est-elle viable ?

D'avance merci pour vos réponses.



PS : une autre manière de procéder consisterait à mettre l'anticorps secondaire en excès de manière à en faire un dosage en retour dans une autre plaque multipuits. Je ne suis toutefois pas très confiant vis-à-vis de cette technique...
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[invite14397db8]

Les interactions Ac-AG sont de nature électrostatiques non? Une solution ionique ne pourrait-elle pas perturber ces interactions?

[kamor]

Oui c'est ce que j'aurais dit aussi. Et si mes lointains souvenirs de TP sont exacts, je crois que c'est ce qui est utilisé.

[LXR]

Si la solution hypertonique seule ne suffit pas, tu peux combiner avec la chaleur, là c'est radical. Par contre, il faut faire attention à ce que ni la chaleur, ni la force ionique ne dénaturent ou ne modifient ton fluorophore sinon tu auras des problèmes pour la mesure de fluorescence. Pour le tester, tu prend le fluorophore seul (enfin le couple avec anticorps bien sûr) et tu lui fais subir ces conditions, avec un témoin négatif ne subissant rien du tout. En faisant le comparatif, tu t'apercevras vite si tes conditions de récupération de l'anticorps couplé au fluorophore sont bonnes ou pas.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite240ac937]

Pas bête, effectivement.

Auriez-vous des exemples de protocoles, références d'articles là-dessus ?

[LXR]

Pour des immunoprécipitations, tu peux peut-être arriver à trouver des conditions analogues à celles que tu recherches pour ta méthode, dans le cas où les auteurs souhaitent récupérer la protéine immunoprécipitée sans son anticorps, et sans la dénaturer c'est encore mieux. Tu peux aussi regarder les manips où les auteurs effectuent une purification protéique par chromatogrtaphie d'affinité où la phase stationnaire est constituée de billes couplées à un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt. Généralement, ils utilisent la force ionique pour éluer la protéine. Cela peut te permettre de te faire une idée de la composition du tampon utilisé.

[invite240ac937]

Oui, très bonne idée. Je vais commencer à chercher dans cette direction.

Merci à tous pour vos conseils !