Bonjour à tous,
Voici mon problème,
Je voudrais passer tous les gènes d'intérêt qui m'intéresse + les gènes de références pour un échantillon sur la même plaque.
Mais je ne sais pas quels calculs effectuer après!!!!
Faut-il utiliser un calibrateur et si oui comment??
Si je n'utilise pas de calibrateur, comment puis-je normaliser avec les gènes de référence??
Je ne sais pas si je suis assez claire, mais merci d'avance pour vos conseils!!
Bonjour la bretagne ^^
1) Les calculs ne sont pas forcement compliqué, et plus la plupart des machines te permettent de faire l´analyse des données directement à la fin de ta manip.
2) Trouver le bon gène de référence n´est pas à prendre à la légère. Les résultats sont très sensible au changement de gène de référence. Le top se serait que tu cherche dans la littérature des groupes qui ont un projet proche afin de regarder quels gènes ils ont gardé.
Merci pour la rapidité de réponse!
En fait, j'ai l'habitude de travailler avec plusieurs gènes de référence ce qui me permet d'obtenir un facteur de normalisation.
Ce qui me pose problème c'est que d'habitude je consacre une plaque (ou plusieurs selon le nombre d'échantillon) à un gène. Je met en plus un calibrateur qui me permet d'obtenir un delta de Ct pour obtenir la quantité relative (QR).
Je divise ensuite cette QR par le facteur de normalisation pour obtenir la quantité relative normalisée.
Ce que je veux faire maintenant c'est passer pour un échantillons tous les gènes (interets+ 3ref) sur la même plaque. Je ne peux pas mettre un calibrateur par gène. Mon calcul n'est donc plus correct et je suis donc perdue!!!
J'espere avoir mieux exposer mon probleme....
Bonjour,
Je vais apporter plus de questions que de réponses, malheureusement
Je comprends pas ce qu'est ton "calibrateur".
Tu dis qu'il te sert à calculer ton Ct, donc en fait ce que tu appelles "calibrateur", c'est un gène de référence ?
Pourtant, tu parles de "gène de référence" pour calculer un "facteur de normalisation" (comment tu le calcules d'ailleurs ce facteur ?)
=> Je suis perdu ^_^
Bref : ΔCt = Ct(cible) - Ct(ref).
Ta référence, par définition, ne change pas pour chaque gène dont tu étudies l'expression...
Donc, pourquoi vouloir "mettre un calibrateur pour chaque gène" (je te cite) ?
A moins que ton "calibrateur" soit une quantitée connue de cDNA pour un gène donnée ?
Mais alors dans ce cas, connaissant l'efficacité de qPCR et le nombre de cycles pour atteindre le Ct, c'est plus une quantification relative mais absolue que tu fais ...
Ceci mis à part, concernant ta normalisation, tu l'utilisais pour pouvoir comparer des résultats issus de plusieurs qPCR différentes, c'est bien ça ?
Mais ici, si tu connais avec précision l'efficacité de ta qPCR pour chaque couple de primers dans les conditions que utilises pour ta plaque, que tu mets tous tes gènes sur la même plaque, tu devrais pouvoir t'en sortir avec une quantification relative à l'aide un gène de référence, et ainsi pouvoir donner une idée du niveau d'expression de chaque gène par rapport aux autres.
Pourquoi vouloir "normaliser" en plus ?
Bonjour,
Bon aparemment je ne me suis pas très bien exprimée (désolé ca n'a jamais été mon fort d'expliquer des trucs!!!)
Pour le calibrateur qu'on utilise habituellement dans mon labo c'est un pool d'echantillon. Il me permet de normaliser les plaques entre-elles quand on travail gène par gène (c a d passer pour un gène tous les echantillons sur une meme plaque ou plusieurs selon le nombre d'echantillons). C'est une correction de la variabilité inter-plaques...
Cependant en faisant un peu de biblio ( enfin en essayant... ^^) je me suis rendure compte que la notion de calibrateur pouvait etre toute autre, d'ou ton incompréhension...
En ce qui concerne les gènes de référence, il me semble que plusieurs logiciel existe pour calculer un facteur de normalisation (nous on utilise GeNorm). La normalisation est plus robuste.
J'avais penser a normaliser comme tu le disais avec le gène référence et faire comme tu le marques ΔCt = Ct(cible) - Ct(ref). puis comparer l'expression de mes gèenes d'intérêt par rapport à mon gène de référence. Le problème est que j'utilise non pas 1 mais 3 gènes de référence....
Merci pour ta reflexion et tes questionnements!!
Résumons, pour être sûr que je comprends ton problème (désolé, mais je suis en plein dans les qPCR en ce moment aussi, et je m'aperçois que chaque labo fait sa cuisine perso, et c'est pas toujours facile de se plonger dans une nouvelle recette).
D'habitude tu utilises :
* Un calibrateur, qui te permet de te débarasser des variabilités inter-plaques, et donc de faire une comparaison de l'expression de différents gènes au sein d'un même échantillon.
* 3 gènes de références (lesquels, par curiosité ?), afin de calculer un facteur de normalisation (comment tu le calcules, toujours par curiosité ?), et donc de pouvoir comparer au sein d'une même plaque, l'expression d'un gène dans tes différents échantillons, en considérant que les 3 gènes de références ne varient pas.
Là, ce que tu veux faire, c'est changer de méthode, et placer un seul (ou seulement quelques uns) échantillon sur ta plaque, et utiliser tous les primers possibles sur ce nombre réduit d'échantillon.
Première question : pourquoi changer de méthode ?
Ainsi, ton but c'est de comparer l'expression de différents gènes au sein d'un même échantillon, sachant que tout sera fait sur une même plaque, donc aucune d'une même réaction, le même jour, avec les même mastermix, etc.
Donc deuxième question : pourquoi utiliser un calibrateur ? Il te serviras à rien puisque tu auras tout sur la même plaque !
A moins que tu veuilles, finalement, aussi avoir la possibilité de comparer un même gène dans différents échantillons, donc issus de différentes plaques ? ... Mais tu avais déjà la possibilité de le faire avant, avec ton autre méthode ; donc on en revient à la première question : pourquoi tout changer ?
Mais admettons que tu doives changer de méthode et calculer un calibrateur.
Avant, tu poolais des échantillons avec une proportion/quantité donnée pour chacun, tu amplifiais un gène de référence, et tu considérait que cette valeur ne devait jamais changer entre tes différentes plaques.
Ce que tu peux peut-être faire ici, c'est utiliser pour chaque plaque une quantitée connue de cDNA et l'amplifier : c'est ton calibrateur.
Mais quitte à me répéter, je pense que pour comparer n gènes sur un même échantillon, tu n'as besoin que d'un seul gène de référence (à bien choisir, comme l'a dit Nicolas.Ca), et que tu dois garder toujours le même dans tes différentes manips.
Et je passe la main aux suivants, car je suis bien loin d'avoir une grande expérience de la qPCR !
