Probleme western blot!!
Bonjour, depuis quelques temps j'ai un problème avec mes western, il n'y a pas de proteine de haut poids moléculaire! pourtant comme vous pouvez le voir il ne s'agit pas d'un problème de transfert car certain échantillon ainsi que le marqueur ont des proteines de haut poids!!! avez vous une explication?? Merci (photo jointe)
quelle(s) est(sont) la(les) différence(s) entre les échantillons ?
Pas de différence entre les échantillons! ce sont differents mutants mais précedemment lors d'autres extractions et western ils migraient très bien!
ça peut être tellement de choses...
C'est la même quantité partout ?
A priori oui! il y a quelques différences par rapport aux pipettes mais normalement c'est quasi la même chose
Bonjour.
C'est quoi comme échantillon?
Extraits totaux?
Tu utilises quelle méthode pour les préparer?
Extrait totaux de cellule Hela, extrait en RIPA + antiprotease de chez roche!
tu parts de quelle quantité de cellules? quelle quantité déposée sur gel?Envoyé par fosfie
Est-ce qu'il serait possible que certains echantillons aient été chauffés et d'autres non?
YOyo
La c'était 75ug mais ca me le fait a 50 et 100ug de proteines! les échantillons n'ont pas était chauffé. Ils ont juste était préparé le jour précédent le western (lammly buffer ajouté) et congelé, gel préparé également le jour d'avant (mis au frigo dans su tampon d'éléctrophorèse)
tu ne dénatures pas avant de déposer ?
100µg sur un gel c'est énormément beaucoup.
Non je ne dénature pas je laisse un bon moment a temperature ambiante mais je ne dénature pas!! je sais que 100ug c'est beaucoup mais c'est ce qu'il faut pour sortir la protéine!
Oui en effet, on met de l'ordre du microgramme sur gel, tu es 100 fois plus concentré que ce que je mets d'habitude. J'utilise généralement 400ng.
en prot ?
400ng de proteine?!! mais c'est minuscule ton gène doit être vraiment très très facile a detecter!! mon plus simple je le sort a 30ug de proteine!!!
