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Probleme western blot!!



  1. #1
    fosfie

    Unhappy Probleme western blot!!

    Bonjour, depuis quelques temps j'ai un problème avec mes western, il n'y a pas de proteine de haut poids moléculaire! pourtant comme vous pouvez le voir il ne s'agit pas d'un problème de transfert car certain échantillon ainsi que le marqueur ont des proteines de haut poids!!! avez vous une explication?? Merci (photo jointe)

    -----

    Images attachées Images attachées

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  3. #2
    Flyingbike

    Re : Probleme western blot!!

    quelle(s) est(sont) la(les) différence(s) entre les échantillons ?

  4. #3
    fosfie

    Re : Probleme western blot!!

    Pas de différence entre les échantillons! ce sont differents mutants mais précedemment lors d'autres extractions et western ils migraient très bien!

  5. #4
    Flyingbike

    Re : Probleme western blot!!

    ça peut être tellement de choses...
    C'est la même quantité partout ?

  6. #5
    fosfie

    Re : Probleme western blot!!

    A priori oui! il y a quelques différences par rapport aux pipettes mais normalement c'est quasi la même chose

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    ratafouin

    Re : Probleme western blot!!

    Bonjour.
    C'est quoi comme échantillon?
    Extraits totaux?
    Tu utilises quelle méthode pour les préparer?

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  10. #7
    fosfie

    Re : Probleme western blot!!

    Extrait totaux de cellule Hela, extrait en RIPA + antiprotease de chez roche!

  11. #8
    Yoyo

    Re : Probleme western blot!!

    Citation Envoyé par fosfie Voir le message
    Extrait totaux de cellule Hela, extrait en RIPA + antiprotease de chez roche!
    tu parts de quelle quantité de cellules? quelle quantité déposée sur gel?

    Est-ce qu'il serait possible que certains echantillons aient été chauffés et d'autres non?

    YOyo

  12. #9
    fosfie

    Re : Probleme western blot!!

    La c'était 75ug mais ca me le fait a 50 et 100ug de proteines! les échantillons n'ont pas était chauffé. Ils ont juste était préparé le jour précédent le western (lammly buffer ajouté) et congelé, gel préparé également le jour d'avant (mis au frigo dans su tampon d'éléctrophorèse)

  13. #10
    Flyingbike

    Re : Probleme western blot!!

    tu ne dénatures pas avant de déposer ?
    100µg sur un gel c'est énormément beaucoup.

  14. #11
    fosfie

    Re : Probleme western blot!!

    Non je ne dénature pas je laisse un bon moment a temperature ambiante mais je ne dénature pas!! je sais que 100ug c'est beaucoup mais c'est ce qu'il faut pour sortir la protéine!

  15. #12
    Aqualung

    Re : Probleme western blot!!

    Oui en effet, on met de l'ordre du microgramme sur gel, tu es 100 fois plus concentré que ce que je mets d'habitude. J'utilise généralement 400ng.

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  17. #13
    Flyingbike

    Re : Probleme western blot!!

    Citation Envoyé par Aqualung Voir le message
    Oui en effet, on met de l'ordre du microgramme sur gel, tu es 100 fois plus concentré que ce que je mets d'habitude. J'utilise généralement 400ng.
    en prot ?

  18. #14
    fosfie

    Re : Probleme western blot!!

    400ng de proteine?!! mais c'est minuscule ton gène doit être vraiment très très facile a detecter!! mon plus simple je le sort a 30ug de proteine!!!

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