Clonage orienté, design d'amorces

[invitee170a0e7]

Bonjour à tous

Je me prend le choux depuis le début de la semaine sur la conception de mes amorces pour réaliser un clonage orienté dans des vecteurs d'expressions (un GST : pGEX-5X-1 ; un HIS : pQE30).

Pas de soucis au niveau des choix des enzymes de restrictions mais au niveau du design des amorces... :
1) dois-je inclure l'ATG ? Sachant que pour pQE30 y'en a un en amont juste avec le HIS-tag. Pour le pGEX y'en a aussi un juste avec le cds de la GST

- Si oui, dois-je mettre un contexte d'initiation de la traduction favorable ? (=Kozak)

- Si non, dois-je faire partir ma séquence dès le codon suivant la méthionine ?

2) Dois-je mettre le codon STOP ? Car là encore y'en a déjà dans le vecteur à la fin du MCS.

3) En introduisant les sites de restrictions dans mes amorces, cela peut engendrer un décalage du cadre de lecture... Comment le vérifier ? (j'ai essayé des logiciels comme Geneious & Co... mais ne maitrisant pas ces logiciels j'ai perdu plus de temps qu'autre chose )

4) Une fois que tout sera Ok. Est-il nécessaire de passer par un sous-clonage ?

- Si oui, pourquoi ?
- Si non, peut-on juste purifier l'insert puis digérer puis ligation dans le vecteur d'expression ?

Merci
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[invite9b2a5846]

Le lieux est de trouver pour chaque vecteur le handbook qui explique tout par ex pour les pGEX:
http://www.fishersci.com/ecomm/servl...922_29104_-1_0

pour pGEX 5X 1 , après la GST tu as le site de cleavage avec le facteur Xa et après avant le stop BamHI ... XhoI ... NotI. il faut donc cloner ton géné d'intérêt avec ou sans l'atg de départ (ça ne change rien) entre ces enzymes et avec ou sans stop puisque de toutes façons il reste un stop derrière. Bien vérifier que tout est en phase.
Logiciels super et gratuit: Ape et surtout Serial Cloner (discussion sur futura). Tu sélectionnes entre l'atg de la GST et le stop qui suit ta prot et tu "translate". Si dans la séquence d'aa tu n'as pas de * qui correspon à un stop c'est OK

je ne comprends pas l'histoire du sous clonage

quand à la séquence Kozak, vu la séquence de pGEX 5T-1 il n'y en a pas devant la GST alors n'en mets pas devant ta protéine

[invitee170a0e7]

Justement, comment vérifier que tout est en phase ?
prenons par exemple le couple d'amorce suivant (pour pGEX)

EcorI-FOR : 5' cg gaa ttc ATG XXX XXX XXX XXX XXX 3'
XhoI-REV : 5' cg ctc gag TTA XXX XXX XXX XXX XXX 3'

d'après moi, il serait en phase... est-ce le cas ?

Pour le sous-clonage, c'est juste que j'ai envie de gagner du temps. Si je peux directement passer mon produit d'amplification dans mon vecteur d'expression, ça me fait gagner 2/3 jours ^^. Donc je cherche à savoir si c'est possible et si oui comment (précaution à prendre, etc...). Car le sous-clonage (vecteur de "propagation") permet d'avoir une grosse quantité de son insert, propre, et avec les extrémités adéquates pour ensuite refaire un clonage mais dans le vecteur d'expression de la future protéine recombinante.

Merci pour le conseil de logiciel, je regarde ça.

[invite02cefc91]

Bonjour,

Moi je fais jamais de sous clonage, je clone direct dans le plasmique d'intérêt. Il suffit de dessiner tes amorces en conséquence.

Pour qu'une bonne digestion se fasse sur un produit pcr, il faut généralement que ton site de restriction soit entouré de nucléotides de part et d'autre. Donc il ne faut pas juste rajouter ton site de restriction à ton primer, mais aussi des nucléotides supplémentaires. En général, j'en mets au moins 5 avant le site de restriction ...

Après tu peux jouer sur la digestion pour vraiment digérer ton fragment. Généralement, je digère en deux fois avec moitié moins d'amorce. Ça donne en gros, 1h30-2h de digestion avec moitié d'enzyme, puis je viens rajouter l'autre moitié et je laisse 1h30-2h ...

Après j'ai encore plein d'astuces ....

et j'ai jamais eu de souci même pour les grands fragments. Je clone 7kb sans réel souci ..

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee170a0e7]

qu'entends-tu par "je digère en 2x avec moitié moins d'amorce" ?
tu ne digères pas directement ton produit PCR ? Tu rajoutes tes oligos ?

Sinon je suis toujours embêté dans la construction de mes amorces. Je cale sur ce fichu cadre de lecture !

je vais regarder via Serial Cloner

[invite02cefc91]

Pardon pas amorces, enzyme ... Je digères en deux fois mon produit avec deux fois moins d'enzyme ..

[invite02cefc91]

et pour ton problème de cadre de lecture, moi si j'étais toi j'inclurais l'ATG et le STOP ....
Après tes sites de restriction ne vont pas engendrés de décalage cadre de lecture puisque c'est un multiple de 3 ...

Essayes avec Ape comme logiciel, tu construis la carte et avec la fonction traduire, tu verras tout de suite si ca code la bonne chose

[invitee170a0e7]

Merci pour vos précieux conseils !
j'ai passé un peu de temps ce WE à utiliser Serial Cloner et ApE, et maintenant je sais utiliser les fonctions de bases et répondre à mes interrogations

Reste plus qu'à vérifier expérimentalement...

@malesore : une fois ton produit PCR obtenu, tu le purifies avant de digérer par les enzymes de restriction ? ou tu purifies après l'étape de digestion ?

[invite02cefc91]

Généralement, je purifie avant et après digestion.

Je purifie après la PCR pour ne garder que l'ADN et virer tous les tampons qui pourraient gêner les enzymes de restriction.

Après je digère en deux étapes :
- la 1ère je digère l'ensemble de mon produit PCR purifié dans 50 uL pendant 1h30 avec un 1ère moitié d'enzyme (généralement 5U)
- puis je rajoute 10 ul supplémentaire avec l'autre moitié d'enzyme pendant 1h30

Je purifie ensuite avant de faire ma ligation



Des conseils pour la ligation ?