Design d'amorces, plasmides

[invite44dd9300]

Bonsoir,

J'ai un devoir de génétique à faire et je dois avouer qu'il me donne beaucoup de fil à retordre. Je dois insérer une séquence d'ADN dans un plasmide. Cette séquence d'ADN a été obtenue à partir d'ARN en faisant une RT. Puis, il faut amplifier l'ADN avec une PCR. Pour l'amplifier, il faut donc designer des amorces qui doivent servir à introduire cette séquence dans des plasmides. Voici les différentes étapes que je dois suivre:

1. Find the required sequence (use FASTA format) from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (Nucleotide) and paste it
into a text file. First search for human amyloid beta mRNA; as you can see, there are several possibilities.
Use GenBank identifier NM_000484 to find the sequence we want.

J'ai bien trouvé cette séquence au format FASTA au lien suivant:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/...a&log$=seqview

Ma première question dois-je considérer que cette séquence est déjà épissée? Dans ce cas pourquoi elle ne débute pas avec le codon ATG?Dans ce même ordre d'idée je me posais une autre question, est-ce vraiment ATG qui code pour le codon START (AUG) ou son complémentaire TAC? Ou dit autrement est-ce que lors de la transcription on obtient bien un ARN complémentaire au brin d'ADN transcrit?

Dans le cas où cette séquence ne serait pas épissée, dois-je enlever manuellement tous les introns?ou n'est-ce pas une bonne idée?

Dans un deuxième temps, je dois designer des amorces, afin d'insérer la séquence d'ADN codante dans un plasmide. Donc, ces séquences doivent reconnaitre spécifiquement les deux extrémités de la séquence d'ADN codante, en plus de contenir des sites de restriction pour introduire la séquence dans un plasmide (après la PCR). La question: où commence et finit la séquence codante à introduire ? Doit-elle contenir une chaine polyA ou doit-elle être plus courte ?


Merci d'avance, j'en profite pour saluer le niveau des réponses que j'ai obtenues jusqu'à présent et je recommande ce forum à tous les nouveaux arrivants.
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[Edelweiss68]

Ma première question dois-je considérer que cette séquence est déjà épissée? Dans ce cas pourquoi elle ne débute pas avec le codon ATG?Dans ce même ordre d'idée je me posais une autre question, est-ce vraiment ATG qui code pour le codon START (AUG) ou son complémentaire TAC? Ou dit autrement est-ce que lors de la transcription on obtient bien un ARN complémentaire au brin d'ADN transcrit?

Dans le cas où cette séquence ne serait pas épissée, dois-je enlever manuellement tous les introns?ou n'est-ce pas une bonne idée?

Dans un deuxième temps, je dois designer des amorces, afin d'insérer la séquence d'ADN codante dans un plasmide. Donc, ces séquences doivent reconnaitre spécifiquement les deux extrémités de la séquence d'ADN codante, en plus de contenir des sites de restriction pour introduire la séquence dans un plasmide (après la PCR). La question: où commence et finit la séquence codante à introduire ? Doit-elle contenir une chaine polyA ou doit-elle être plus courte ?

Bonsoir!

Alors, je n'ai pas regardé ta séquence mais même si il s'agit de ton transcrit mature n'ayant que des exons, le premier exon ne commence pas forcément par AUG. En effet, que ce soit en 5' ou en 3' tu as ce que l'on appelle les régions transcrites non traduites (UTR). Il faut donc chercher quand tu as la succession du A du U et du G.

C'est vraiment l'AUG qui initie la traduction, l'ARNt correspondant à l'anticodon UAC à l'une de ses extrémités et la méthionine à l'autre.

Donc au niveau de l'ADN sur le brin sens tu auras ATG et en face sur le brin anti-sens TAC.

J'admire ton initiative mais même avec une énorme volonté, à moins d'avoir la séquence protéique, trouver les limites entre les introns et les exons est loin d'être évident! Même les logiciels se trompent, on a que des pistes!

Pour tes amorces si tu as de l'ADNc je dirais qu'il faut les dessiner dans les parties UTR. La partie traduite commence à l'AUG et s'arrête au premier codon stop rencontré (UAG, UGA ou UAA). Pourquoi veux tu mettre une chaîne polyA? Cette chaîne sert normalement à protéger l'ARNm des RNases.

Voilà, bonne soirée

[invite44dd9300]

Merci beaucoup en tout cas pour les informations que tu m'as fournies. J'avoue avoir eu un peu de peine avec ce problème...Ma fois je n'ai pas fait l'exercice (pratiquement personne n'y est arrivé). Mais j'ai quand même compris quelques notions importantes. merci encore pour ton aide.

à plus

[invitecf4a7f2b]

bonsoir Idrees,

en fait la séquence que tu devrais prendre n'est celle que qui correspond avec le lien , sur la page ou tu cherches la séquence , avant d'aller sur Fasta , tu dois descendre en bas de la page et prendre CDS , du coup tu aura que la séquence codante.et quand tu regarde cette séquence tu verra trés bien qu'elle commence avec le codan ATG.

à bientot

[A voir en vidéo sur Futura]