Comment design des amorces PCR..

[baylife]

Bonjour à tous!

Voilà j'ai quelques petites difficultés pour designer mes amorces PCR..voici mes questions :

1. Faut-il compter les bases des clamps et des sites de restrictions pour calculer la Tm ? (les prendreen compte fait tout passer au dessus de 60 et c'est pas super sur le papier..)
2. J'ai un petit problème avec un exo, et ça s'annonce comme ça : On a un ADN double brin coupé par BamH1 (le site en 5' est juste avant l'ATG, celui en 3' juste après le STOP) et on veut l'insérer dans un plasmide digéré par Sma1, on a les sites : BamH1 G/GATCC & Sma1 CCC/GGG

Pour les extrémités de l'insert après digestion par les RE respectives on nous donne : 5' GATCC______G
.............................. .............................. .............................. ............................ 3'........ G______CCTAG

Bref je comprends pas pourquoi on a complètement retourné les sites qu'ils nous ont donnés (à part s'ils les avaient écrits de 3' en 5' mais c'est pas indiqué)

Pareil pour les extrémités du vecteur, 5' GGG___CCC 3'
.............................. .......................3' CCC___GGG

Voilà, si quelqu'un pouvait me donner le déclic ça serait super, merci
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[franckeeuuhh]

j'avoue que là je ne comprend pas bien ce qui te choque pour les 2 questions.
Pour ton calcul de Tm tu prends juste en compte le nombre de ((A+T)*2)+((G+C)*4). Je ne vois pas pourquoi tu devrais prendre en compte un site de restriction sauf si tu l'insert par PCR en 5' et 3'... Dans ce cas je te conseil de faire ta PCR avec 8 cycles au Ta de la partie qui bind complètement et ensuite le reste de tes cycles avec le Ta total ou autre solution tu fais un gradient tous les 5 degrés avec 35 cycles lol (méthode terminator)

Pour l'histoire des sites de restrictions là par contre ... J'ai pas compris l'histoire de retourner les sites... ils sont dans le bon sens tes sites. Par contre si rien d'autre ne te choque alors là tu as un problème!!!

[baylife]

j'avoue que là je ne comprend pas bien ce qui te choque pour les 2 questions.
Pour ton calcul de Tm tu prends juste en compte le nombre de ((A+T)*2)+((G+C)*4). Je ne vois pas pourquoi tu devrais prendre en compte un site de restriction sauf si tu l'insert par PCR en 5' et 3'... Dans ce cas je te conseil de faire ta PCR avec 8 cycles au Ta de la partie qui bind complètement et ensuite le reste de tes cycles avec le Ta total ou autre solution tu fais un gradient tous les 5 degrés avec 35 cycles lol (méthode terminator)

Pour l'histoire des sites de restrictions là par contre ... J'ai pas compris l'histoire de retourner les sites... ils sont dans le bon sens tes sites. Par contre si rien d'autre ne te choque alors là tu as un problème!!!

Bah oui justement le site de restriction je dois le mettre au début de mes amorces pour pouvoir l'insérer ensuite dans le plasmide de la bactérie digérée par BamH1 et Sma1. Mais je sais pas s'il faut compter les nucléotides (qui font donc partie de l'amorce!!!) du camp et des sites de restrictions pour le calcul de la Tm ! (et ok pour tes propositions de méthodes je note )

Et en fait ouais je m'étais emmêlé les pinceaux avec les sites de restriction, sur ma fiche ils étaient ecrits à l'envers, donc j'ai fait n'importe quoi en faisant les premières amorces.
Pour le truc qui devrait me choquer je sais pas de quoi tu parles, à part le fait que j'ai pas mentionné qu'on utilise une polyIII pour compléter l'insert du double brin (donc celui digéré par Bamh1)

[franckeeuuhh]

oui oui oui tu dois bien les mettre en 5' de tes amorces. C'est pour ça que je te propose de faire une PCR en 2 cycles, le premier cycle avec seulement la partie qui bind 100% va te permettre de créer quelques amplicons avec ton site et ensuite tu prends le Ta de ton full primer pour faire le 2ème cycle.
Pour BamHI tu n'avais pas dis que tu utiliserais de la Klenow c'est pour ça que j'ai bloqué, mais avec de la Klenow alors ça va!

[A voir en vidéo sur Futura]

[baylife]

oui oui oui tu dois bien les mettre en 5' de tes amorces. C'est pour ça que je te propose de faire une PCR en 2 cycles, le premier cycle avec seulement la partie qui bind 100% va te permettre de créer quelques amplicons avec ton site et ensuite tu prends le Ta de ton full primer pour faire le 2ème cycle.
Pour BamHI tu n'avais pas dis que tu utiliserais de la Klenow c'est pour ça que j'ai bloqué, mais avec de la Klenow alors ça va!

OK merci beaucoup