Bonjour,
voila j'ai un problème que j'ai du mal à résoudre, je dois designer des amorces PCR sur une séquence :
GGGGAAAAAGGTAAGATTAAAGGGCTAAAT GTGTGCATTGTGCATACGATTTCARGCA[TGA/---] AGGAARTTGGTCCRTCAAGAATCAAAATAA SKAATCT
Quel site en ligne permet de designer l'insertion de trois nucléotide?
en vous remerciant,
Managua
Des amorces ne permettent pas d'insérer des nucléotides à proprement parler, puisqu'elles servent à la PCR.
Ta séquence : GGGGAAAAAGGTAAGATTAAAGGGCTAAAT GTGTGCATTGTGCATACGATTTCARGCA[TGA/---] AGGAARTTGGTCCRTCAAGAATCAAAATAA
J'ai pour habitude d'amorcer sur 20 Nt mais ta séquence est assez courte alors je partirai sur 15.
Une des deux amorce correspond tout simplement à la séquence formée par les 15 premiers Nt. L'autre amorce correspond aux 15 Nt complémentaire des 15 derniers Nt de ta séquence à amplifier.
Tes amorces en rouge :
Code:GGGGAAAAAG GTAAGATTAA AGGGCTAAAT GTGTGCATTG TGCATACGAT TTCATGCA[TG A/---]AGGAAT TTGGTCCTTC AAGAATCAAA ATAA CCCCTTTTTC CATTCTAATT TCCCGATTTA CACACGTAAC ACGTATGCTA AAGTACGT[AC T/---]TCCTTA AACCAGGAAG TTCTTAGTTT TATT
Tout d'abord merci de votre aide, quel logiciel avez vous utilisé? D'habitude, je design des amorces pour des marqueur SNP..
C'est un plaisir.
Il n'y a pas nécessité de logiciel pour déterminer les amorces d'une PCR.
C'est tout bête, il suffit d'appliquer le principe que j'ai énoncé précédemment, en fait. A savoir : Une des deux amorce correspond tout simplement à la séquence formée par les 15 premiers Nt. L'autre amorce correspond aux 15 Nt complémentaires des 15 derniers Nt de ta séquence à amplifier.
Attention bien sûr au sens 5'==>3'. (la deuxième ligne est donc à inverser)
Juste une question, cela ne va pas m'amplifier spécifiquement l'insertion donc ici..
Bonsoir
Tout ceci sera plus à sa place en bio !
Pour la modération
Non ça ne va pas amplifier spécifiquement ton insertion. Mais en biologie moléculaire bien des choses sont possibles.
Donc une solution :
Tu procèdes à l'insertion puis tu effectues un southern blot spécifique à l'insert pour ne récupérer que de l'ADN+insert. A partir de là aucun doute, la PCR n'amplifiera que le fragment ADN+insert puisqu'il n'y aura que lui dans tes microtubes.
Bonjour, si cette séquence est contenue dans un plasmide, le plus simple est de faire une mutagénèse dirigée. CàD, faire un couple d'oligos complémentaires avec en leur centre les 3nt à ajouter avec au moins 15nt de chaque côté pour un Tm total d'environ 78° C. Ensuite amplifier le plasmide par PCR, digérer par DpnI la matrice et transformer des bactéries avec ce produit.
