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clonage orienté ou non



  1. #1
    (phosphatidyl)choline

    clonage orienté ou non


    ------

    bonjour !

    je voulais savoir si quelqu'un pourrait m'expliquer d'une facon simple la différence entre un clonage orienté et un clonage non orienté en génie génétique.

    est ce que cela aurait un rapport avec les sites de restrictions des deu fragents que l'on veut cloner?

    dans mon cas on parle de plasmides.

    et au passage qu'est ce que le cadre de lecture ouverte? est ce la sequence codante exit promoteur et terminateur?

    merci d'avance

    -----

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  3. #2
    Morphine

    Re : clonage orienté ou non

    Bonjour,
    http://fr.wikipedia.org/wiki/Phase_ouverte_de_lecture

    Concernant les différents types de clonages, celà dépend effectivement de la stratégie adopter pour le clonage via le choix des enzymes de restriction.

    Faisons simple, si je digére un plasmide (qui est circulaire) par une enzyme A, je vais libérer deux extrémités A.
    Si le fragment que je désire insérer dans ce plasmide possède également deux extrémités A, il peut alors s'insérer indfféremment dans le plasmide selon deux orientations.

    ==========A A1-----------------A2 A========

    ==========A A2-----------------A1 A========


    ===== Plasmide
    --------- Insert
    Remarque: les extrémités que j'ai nommé A1 etA2 sont identiques. Je les nomme différemment par soucis de clarté.

    On peut être amener à effectuer ce genre de clonage lorsque l'on réalise des banques oû l'on désire seulement isoler chaque gène composant un génome dans un plasmide.

    Par contre, si on réalise un clonage ayant pour but d'exprimer une protéine, l'orientation de notre insert dans le plasmide d'expression sera primordial pour que le couplage transcription/traduction se réalise.
    C'est un clonage dit orienté qui implique différentes enzymes de restriction judicieusement choisies.
    On digerait alors le plasmide et l'insert par des enzymes différentes A et B générant des sites de restriction non compatibles.

    ==========A A-----------------B B========

    ===== Plasmide
    --------- Insert

    serait le seul clonage possible, les site A et B générésr par digestion étant incompatibles.

    En espérant avoir été assez clair.

    Morphine

  4. #3
    MaliciaR

    Re : clonage orienté ou non

    Bonjour,

    Juste pour rajouter une chose à la très bonne explication donnée par Morphine : lorsque l'on parle d'extrémités ici, on parle d'extrémités cohésives, non pas à bouts francs.

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  5. #4
    (phosphatidyl)choline

    Re : clonage orienté ou non

    super c'est plus clair merci beaucoup ! juste une précision,

    ==========A A-----------------B B========

    ici le plasmide a deux sites de restrictions différents mais identiques aux deux sites de reastriction de l'insert? je ne sais pas si j'ai été claire en gros
    A=A
    B=B

    enfin bref dans le 2ème cas il faut choisir deux sites de restriction différents mais que plasmide et insert on en commun ?

    merci !

  6. #5
    Morphine

    Re : clonage orienté ou non

    Salut,

    tu as tout compris, c'est bien celà!

    Morphine

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    MaliciaR

    Re : clonage orienté ou non

    Citation Envoyé par (phosphatidyl)choline Voir le message
    enfin bref dans le 2ème cas il faut choisir deux sites de restriction différents mais que plasmide et insert on en commun ?
    Hello,

    Je suis d'humeur vicieuse aujourd'hui Et comment tu ferais si tu disposais de plusieurs enzymes de restriction, mais tu n'as pas de site de restriction pour la même au sein de l'insert?

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

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  10. #7
    (phosphatidyl)choline

    Re : clonage orienté ou non

    une pcr avec hybridation d'une amorce contenant le site de restriction??

  11. #8
    piwi

    Re : clonage orienté ou non

    Je suis d'humeur vicieuse aujourd'hui Et comment tu ferais si tu disposais de plusieurs enzymes de restriction, mais tu n'as pas de site de restriction pour la même au sein de l'insert?
    Effectivement c'est vicieux, j'ai rien compris à ce que tu voulais dire.... Tu peux reformuler ta proposition?

    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  12. #9
    MaliciaR

    Re : clonage orienté ou non

    Piwi, ne sois pas méchant, je n'avais pas encore pris le café

    En fait, ma question était de savoir comment faire si l'enzyme B (pour reprendre la nomenclature ci-dessus) n'a pas de site de restriction au sein de la séquence de l'insert.

    Le créer par PCR est une très bonne idée, mais il y a plus simple. C'est pour cette raison que j'ai parlé de "plusieurs enzymes de restriction". En effet, si l'on regarde bien, il y a des enzymes qui clivent des séquences semblables, du genre BglII et BamHI : 5'A^GATCT3' et 5'G^GATCC3', respectivement.
    C'est une chose qu'on a due faire en TP

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  13. #10
    piwi

    Re : clonage orienté ou non

    Pour la petite histoire je me suis amusé aussi exactement avec les mêmes enzymes récemment. Du BamHI dans le plasmide et mon insert BglII. Ca marche au poil mais ça n'est pas orienté du coup (on parle d'enzymes compatibles entre elles).
    Question subsidiaire: Avez vous une idée pour screener vos colonies sans faire de restriction?

    Sinon moi j'ai une autre question.
    Vous devez cloner en phase dans votre plasmide et ce absolument dans un site EcoRI par exemple. Evidemment comme le monde est mal fait il n'y a pas de site EcoRI dans votre insert...
    Proposez donc deux solutions pour s'en sortir.


    Bienvenue dans la rubrique exercices

    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  14. #11
    MaliciaR

    Re : clonage orienté ou non

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Pour la petite histoire je me suis amusé aussi exactement avec les mêmes enzymes récemment. Du BamHI dans le plasmide et mon insert BglII. Ca marche au poil mais ça n'est pas orienté du coup (on parle d'enzymes compatibles entre elles).
    On a fait ça pour l'une des extrémités seulement, l'autre ne suivait pas la loi de l'emmerdement maximal et on a pu utiliser EcoRI

    Question subsidiaire: Avez vous une idée pour screener vos colonies sans faire de restriction?

    Sinon moi j'ai une autre question.
    Vous devez cloner en phase dans votre plasmide et ce absolument dans un site EcoRI par exemple. Evidemment comme le monde est mal fait il n'y a pas de site EcoRI dans votre insert...
    Proposez donc deux solutions pour s'en sortir.


    Bienvenue dans la rubrique exercices

    piwi
    Bon courage au concerné

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  15. #12
    Yoyo

    Re : clonage orienté ou non

    Citation Envoyé par piwi Voir le message

    Sinon moi j'ai une autre question.
    Vous devez cloner en phase dans votre plasmide et ce absolument dans un site EcoRI par exemple. Evidemment comme le monde est mal fait il n'y a pas de site EcoRI dans votre insert...
    Proposez donc deux solutions pour s'en sortir.
    1_ tu mets un site dans ton insert par PCR
    2_ Tu remplis ton site ecoRI pour le rendre bout franc et tu y clones dans la bonne phase ton insert

    YOyo

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  17. #13
    piwi

    Re : clonage orienté ou non

    Qu'est ce que tu es forttttt!!!!!!!!!!

    Sinon y a une troisième option sans faire de ligation en désignant des oligos nucléotides hybrides pour faire une PCR. (Vive la bio mol et ses astuces de Sioux!)
    Oligos: 20 bases complémentaires au plasmide linéarisé EcoRI + 20 bases complémentaires à l'insert.
    On fait la PCR et on obtient donc l'insert avec à chacune des extrémités 20 bases complémentaires au plasmides.
    On transforme directement les bactéries avec le fragment PCR et le plasmide linéarisé. Et là, la recombinaison homologue fait le reste.
    C'est orienté, c'est propre puisque normalement le plasmide linéaire est dégradé par les bactéries. On aura donc que des colonies avec le plasmide recombiné.

    Nouvelles questions:
    Mon insert initial est dans un plasmide donneur. Quand je transforme j'ai un énorme bruit de fond avec ce premier plasmide. Comment diminuer ce bruit de fond? (Astuce super importante à connaitre quand on clone à partir de plasmides donneurs)

    Manifestement mon plasmide receveur est mal linéarisé et quand je screene par PCR (j'en ai déjà fais une plaque entière) je ne vois que des colonies vides (bruit de fond). Comment retrouver mes petits malgré tout sans faire des tonnes de PCR?


    Je vais peut être placer toutes ces questions dans la rubrique exo. Je trouve que l'ensemble donne quelque chose d'assez intéressant.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  18. #14
    Yoyo

    Re : clonage orienté ou non

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Qu'est ce que tu es forttttt!!!!!!!!!!

    Sinon y a une troisième option sans faire de ligation en désignant des oligos nucléotides hybrides pour faire une PCR. (Vive la bio mol et ses astuces de Sioux!)
    Oligos: 20 bases complémentaires au plasmide linéarisé EcoRI + 20 bases complémentaires à l'insert.
    On fait la PCR et on obtient donc l'insert avec à chacune des extrémités 20 bases complémentaires au plasmides.
    On transforme directement les bactéries avec le fragment PCR et le plasmide linéarisé. Et là, la recombinaison homologue fait le reste.
    C'est orienté, c'est propre puisque normalement le plasmide linéaire est dégradé par les bactéries. On aura donc que des colonies avec le plasmide recombiné.
    Elles font ca les bacteries classiques? il me semblait qu'elles etaient recA- pour eviter les remaniements dans les plasmides, mais que du coup elles ne font plus de recombinaisons. Chez la levure 50nt est le minimum obligatoire pour faire cela et la levure fait bcp de recombinaison homologues or il me semblait que pour coli faisait mal la recombinaison homologue?...

    Nouvelles questions:
    Mon insert initial est dans un plasmide donneur. Quand je transforme j'ai un énorme bruit de fond avec ce premier plasmide. Comment diminuer ce bruit de fond? (Astuce super importante à connaitre quand on clone à partir de plasmides donneurs)
    si tu as amplifié ton insert par PCR alors tu te debarasse du plasmide donneur en traitant la reaction de PCR avec l'enzyme dpnI ca marche super bien.
    Si tu sort ton insert par restriction, j'imagine que tu dois pouvoir trouver un site de restriction qui te detruise ton plasmide donneur. Mais il sera toujours preferable de bien purifier ton insert sur gel pour te debarasser au maximum du plasmide donneur.
    Ce que je fais pour eviter ce genre de soucis est que j'utilise souvent des plasmides avec des marqueurs de resistances différents... mais ce n'est pas toujours possible en effet.

    Manifestement mon plasmide receveur est mal linéarisé et quand je screene par PCR (j'en ai déjà fais une plaque entière) je ne vois que des colonies vides (bruit de fond). Comment retrouver mes petits malgré tout sans faire des tonnes de PCR?
    tu recommences ta digestion? lol

    Bon je vais peut etre arreter de repondre a toutes les questions...je suis pas le seul biologiste dans le coin.

    YOyo

  19. #15
    piwi

    Re : clonage orienté ou non

    Pour la recombinaison homolgue oui ça se fait. En théorie ça devrait marcher super bien. Je dis en théorie parce que plusieurs personnes m'ont dit l'avoir fait et avoir eu de très bons résultats, mais quand j'ai essayé moi même, quelle galère...
    La double recombinaison est un évènement rare, et si tu as du bruit de fond c'est vraiment pas simple.

    Sinon oui, DpnI était le mot clé à connaitre. DpnI est une enzyme de restriction qui coupe un site de 4 nucléotides:
    -------DpnI:

    ----------CH3
    ----------|
    ------------5'-GATC-3'
    ------------3'-CTAG-5'
    -------------|
    -------------CH3


    Comme on le voit ici, cette enzyme coupe spécifiquement les sites methylés. Cette methylation ne survient qu' in vivo dans les organismes vivants. Donc dans une PCR faite sur un plasmide seul ce dernier est methylé. Vous ne coupez que le plasmide et ne conservez que votre fragment de PCR.

    Depuis que je connais cette astuce je n'envisage plus un clonage à partir d'un plasmide sans une étape digestion par DpnI. A connaitre!

    Sinon pour retrouver ses petits dans un océan de colonies sans insert l'astuce repose sur une sorte de southern blot in situ. J'en dis pas plus pour l'instant


    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  20. #16
    MaliciaR

    Re : clonage orienté ou non

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Pour la recombinaison homolgue oui ça se fait. En théorie ça devrait marcher super bien. Je dis en théorie parce que plusieurs personnes m'ont dit l'avoir fait et avoir eu de très bons résultats, mais quand j'ai essayé moi même, quelle galère...
    La double recombinaison est un évènement rare, et si tu as du bruit de fond c'est vraiment pas simple.
    Intéressant... J'ai eu la même réaction que Yoyo par rapport au RecA- ...

    Sinon oui, DpnI était le mot clé à connaitre. DpnI est une enzyme de restriction qui coupe un site de 4 nucléotides:
    -------DpnI:

    ----------CH3
    ----------|
    ------------5'-GATC-3'
    ------------3'-CTAG-5'
    -------------|
    -------------CH3


    Comme on le voit ici, cette enzyme coupe spécifiquement les sites methylés. Cette methylation ne survient qu' in vivo dans les organismes vivants. Donc dans une PCR faite sur un plasmide seul ce dernier est methylé. Vous ne coupez que le plasmide et ne conservez que votre fragment de PCR.
    Moi très chiante et moi poser question : et si je cherche à éliminer mon plasmide mais dans une souche Dam- ?

    Depuis que je connais cette astuce je n'envisage plus un clonage à partir d'un plasmide sans une étape digestion par DpnI. A connaitre!
    Je ne connaissais pas, merci, Piwi!

    Sinon pour retrouver ses petits dans un océan de colonies sans insert l'astuce repose sur une sorte de southern blot in situ. J'en dis pas plus pour l'instant
    Gniii, tu poses de ces questions, toi... A tout hasard : tu utilises des sondes couplées à des anticorps ou des ARNi? (Je n'ai jamais fait ce genre de choses, ni en pratique, ni en exo à l'école...).

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  21. #17
    piwi

    Re : clonage orienté ou non

    Dam-?
    Faut être un peu vicieux pour faire ses clonages en se mettant des bâtons dans les roues comme ça
    Le clonage tu le fais dans du Coli tout bête, tout simple...

    Je me demande si il ne vaut pas mieux m'avoir en modérateur qu'a l'exam

    Je veux voir tous les membres du forum major de promo! Ah mais!!

    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  22. #18
    MaliciaR

    Re : clonage orienté ou non

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Dam-?
    Faut être un peu vicieux pour faire ses clonages en se mettant des bâtons dans les roues comme ça
    Le clonage tu le fais dans du Coli tout bête, tout simple...
    C'est juste pour avoir l'air moins bête et un tout petit peu cultivée

    Je me demande si il ne vaut pas mieux m'avoir en modérateur qu'a l'exam

    Je veux voir tous les membres du forum major de promo! Ah mais!!

    piwi
    Ne te demande plus, je t'assure que c'est la réalité vraie!

    Tu files quelques indices pour ton Southern in situ? Sois magnanime, c'est le week-end

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  23. Publicité
  24. #19
    Yoyo

    Re : clonage orienté ou non

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Dam-?
    Faut être un peu vicieux pour faire ses clonages en se mettant des bâtons dans les roues comme ça
    Le clonage tu le fais dans du Coli tout bête, tout simple...
    Oui mais si ton site de clonage est bclI tu dois etre dans une souche dam-dcm- sinon ton enzyme ne coupe pas. Maintenant dans ce cas la, la technique a la DpnI ne marchera pas.

    YOyo

  25. #20
    MaliciaR

    Re : clonage orienté ou non

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Oui mais si ton site de clonage est bclI tu dois etre dans une souche dam-dcm- sinon ton enzyme ne coupe pas. Maintenant dans ce cas la, la technique a la DpnI ne marchera pas.

    YOyo
    Ah, je me disais bien que je ne racontais pas que des âneries
    Et on fait comment dans ce cas, alors?

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  26. #21
    piwi

    Re : clonage orienté ou non

    Dans ce cas là tu peux peut être utiliser une enzyme isoschizomère insensible à la methylation, BsiQI ou Ksp22I et ne pas utiliser une bactos exotique.
    Comme je le disais, vous êtes des vicieux

    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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