Bonjour je voudrais savoir si c'est bien à 65 pendant 5 min puis 50°C pendant 45 qu'on réalise une reverse. Pour finir à 85°C avec la taq.
C'est surtout pour la compréhension 65°C pendant 5 min et les 50°C pendant 45min que j'aurai besoin d'aide!
Et si quelqu'un trouve un schéma expliqué sur le net, ce serait avec plaisir, j'en ai trouvé mais très très simplifié..
Merci d'avance!
Bonjour,
Cela dépend de l'enzyme que tu utilise. Par exemple, avec la M-MLV, il y a une première étape de 5 min à 65°C pour dénaturer les ARN, puis tu rajoute l'enzyme et la réaction se fait à 37°C pendant 50 min. Enfin, il y a une étape de 15 min à 37°C pour inactiver l'enzyme. Les temps et températures peuvent varier en fonction de l'enzyme.
Bonjour,
Il semble que vous ayez une confusion, entre la PCR (polymerase chain reaction), et la reverse transcription.
Cette dernière est la transcription (inverse) d'un RNA, vers son DNA complémentaire. L'enzyme qui permet cette transcription inverse est une "reverse transcriptase" souvent extraite des rétro-virus.
Pour la Taq polymérase, il ne s'agit pas d'une rétro transcriptase, mais d'une DNApolymérase qui résiste aux hautes températures (Extraite de la bactérie Thermus aquaticus), que l'on utilise pour la PCR (Elle n'est pas la seule qui puisse être utilisé, tout dépend du but recherché lors de la PCR).
Pour la PCR simple les températures et les temps couramment utilisés sont :
-étape préliminaire:10-15 minutes à 95 °C : ce qui permet la dénaturation du double brin de DNA, d'homogénéiser, et de casser les éventuelles structures secondaires particulières (tige-boucle, loops, etc...).
les 3 étapes du cycle qui seront répétés environ 30 fois:
-0-1 minute: 95°C: Séparation des DNAs double brin, et libération des polymérases fixés aux cycles précédents.
-0-1 minute: 56-64°C (dépendant de la séquence et la taille des amorces): Fixation des amorces sur les sites complémentaires.
-1-4 minutes: 72°C: permet à la polymérase de se fixer et d'élonger les brins de DNA.
Ensuite, il est possible que vous parliez de la RT-PCR: Qui permet l'amplification du DNAc en partant d'un RNA:
les étapes sont identiques, la seule différence c'est que l'on fait une étape préliminaire, On reverse transcrit nos RNAs par une Reverse Transcriptase, pour obtenir le DNAc, et poursuivre avec une PCR "Classique". Cette étape préliminaire ce réalise généralement entre 40-50°C, dépendant de la Reverse Transcriptase utilisé et de la taille de nos transcrits.
Tous ses protocoles peuvent être adaptés, celons les utilisations que l'on en veut afin d'obtenir de meilleurs optimisations des résultats.
En espérant vous avoir été utile,
Cordialement, Seppesai.
Merci de votre réponse.
Donc alors j'ai réalisé une RT puis une PCR quantitative en temps réelle.
Je suis donc parti d'un ARNm simple brin pour obtenir un ADNc double brin.
Mais c'est juste lors de la RT j'avais du mal à m'expliquer les rôles des températures.
J'ai utilisé la ThermoscriptRT.
65°C je pense que c'est la température à laquelle l'ARNm fixe les oligodt
50°C je pense que c'est la température à laquelle agit la RT! Mais dans le protocole, on utilise une RNAase inhibitrice qui doit aussi agir à cette température là sur la RT j'imagine?
65 : dénaturation des structures secondaires des ARN
50 : température de fonctionnement de l'enzyme
85 : inactivation de l'enzyme
voila
(les températures peuvent changer selon les enzymes, certaines fonctionnent a RT? d'autres a 37, d'autres a 42, etc.)
l'inhibiteur sert a inactiver les RNAses et donc a protéger les ARN, rien a voir avec l'enzyme de la réaction.
Ajoutons qu'en principe il faut refroidir tes échantillons avant l'étape d'élongation (50) pour éviter la reformation des structures secondaires et favoriser l'appariement des oligos.
Ajoutons aussi que RT signifie température ambiante (Room temperature) dans ce contexte là puisque le titre de la discussion pourrait prêter à confusion.
H u m a n i t y
ouh que je suis distrait
Merci la fleur
Normal d'être dans les nuages pour un vélo volant... mais de rien !
H u m a n i t y
Merci à vous pour vos réponses!
Je suis actuellement en BTS bioac et bon vu que vous êtes surement dans la bio je voulais savoir si vous connaissez des domaines qui embauchent plus que d'autres en ce moment, recherche, agro, cosméto?
Désolé de vous retenir!
