Insertion du Bromure d'Ethidium

[invite5ec2d65d]

Bonjour a toutes et a tous,

Esperant que cette question n'est pas déjà dans ce forum.

D’après ce que j'ai compris lors d'une petite recherche, lors d'une RT-PCR et durant la phase de polymérisation le BEt s’insère a la place de certaines paires de bases dans la molécule d'ADN double brin néoformée. jusque la c'est pigé.

ce que je ne comprends pas c'est que, comment peut il s'insserer dans des ADN déjà formés (préparés pour une PCR classique) et qu'on fera migrer sur le gel d'agarose: s'il s'insere,!! ou et comment ? et s'il se lie,!! a quoi et comment?

merci de m’éclaircir sur ça

bonne fin de journée
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[invite853321bf]

Bonjour,
désolé mais c'est mal pigé
Déjà il n'est absolument pas besoin que ce soit lors d'une RT-PCR.
Le BET est un agent intercalant de l'ADN, il s'insère entre les deux brins d'ADN (enfin pour être plus précis entre deux brins d'acide nucléique). Cela entraine un changement de sa conformation qui permet à ce moment l'émission de fluorescence lorsqu'il est excité.
Il ne se fixe pas vraiment, il s'intercale plus précisément dans le petit sillon du double brin.

[invite5ec2d65d]

Bonsoir,

Désolée aussi, a mon tour de vous dire que j'ai bien pigé que ce n'est pas obligé que ça soit une PCR en temps réel "je le sais", d’ailleurs j'ai bien dis que son insertion au cours d'une RT PCR je l'ai comprise (ce qui est logique que l'agent s'intercale au fur et a mesure que l'ADN est entrain de se former en prenant la place des bases), mais ce que vous n'avez pas compris dans ma question est : comment l'agent peut s’insérer dans un ADN déjà formé (ceci c'est vrai que y a un truc qui m'a échappé) : j'explique : je veux faire une PCR classique: a partir de mes extraits d'ARN je fais une synthèse d'ADNc , jusque la c'est clair. alors ces ADNc je vais les faire migrer sur un gel d'agarose (qui contient ce fameux BEt), ces ADN étant déjà formés (il n y a plus l’étape d'appariement de bases pour que le BEt s’insère) alors je reviens a ma question , dans ce cas la comment le BEt peut s'inserer !!

j’espère que mon message est bien passé.

Ps; concernant le petit sillon regarde ce que j'ai trouvé dans un livre concernant ces agents :
il se divisent en deux classes: les agents intercalant comme le bromure d’éthidium, le SYBR Green I, et les agents se fixant au sillon mineur (ce que vous êtes entrain de dire du BEt) comme le Hoeschst 33258...

si vous avez autre chose a me dire, elle sera la bienvenue.

Merci

[piwi]

Ben non, vous n'aviez manifestement pas compris puisque vous imaginiez que le BrEt s'incorpore dans l'ADN durant la phase de polymérisation de la PCR. Raté donc, et inutile de revenir fachée.
Sinon, pour la manière dont le BrEt s'intercale entre les bases de l'ADN, voyez le schéma en bas de cette page: http://www.protocol-online.org/biolo...sts/13350.html

piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite5ec2d65d]

nooooooon fâchée?? pas du tout, je me suis juste dit que j'ai mal formulé ma question c'est tout , c'est pour ça que j'ai réécris un journal

d'accord la polymérisation n'a rien avoir dans tout ça OK. merci pour ça déjà (je viens a peine de trouver ça aussi un très beau schéma a la fin de la page ici http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/P...trophorese.htm

Dites moi piwi d’après un commentaire sur le site proposé : le BET se place entre 2 bases par interaction hydrophobique. vous pouvez m'eclaircir encore plus? ( avant je me disais que l'interaction était peut etre due aux deux charges opposées apparament non )

si vous me répondez sur ça, je serai très contente et j'aurais la réponse a ma question.

merci beaucoup pour vos reponses

[invite853321bf]

Bonsoir,

Désolée aussi, a mon tour de vous dire que j'ai bien pigé que ce n'est pas obligé que ça soit une PCR en temps réel "je le sais", d’ailleurs j'ai bien dis que son insertion au cours d'une RT PCR je l'ai comprise (ce qui est logique que l'agent s'intercale au fur et a mesure que l'ADN est entrain de se former en prenant la place des bases),

Désolé d'être revenu là dessus, mais vu ta formulation, ça ne paraissait pas clair que tu le saches si bien (et j'en doute encore en voyant ce message)

mais ce que vous n'avez pas compris dans ma question est : comment l'agent peut s’insérer dans un ADN déjà formé (ceci c'est vrai que y a un truc qui m'a échappé) : j'explique : je veux faire une PCR classique: a partir de mes extraits d'ARN je fais une synthèse d'ADNc , jusque la c'est clair. alors ces ADNc je vais les faire migrer sur un gel d'agarose (qui contient ce fameux BEt), ces ADN étant déjà formés (il n y a plus l’étape d'appariement de bases pour que le BEt s’insère) alors je reviens a ma question , dans ce cas la comment le BEt peut s'inserer !!

Parce qu'il ne s'y insère pas. Dénature ton ADN, le BET sera libre.

j’espère que mon message est bien passé.

J'espère que le notre aussi

Ps; concernant le petit sillon regarde ce que j'ai trouvé dans un livre concernant ces agents :
il se divisent en deux classes: les agents intercalant comme le bromure d’éthidium, le SYBR Green I, et les agents se fixant au sillon mineur (ce que vous êtes entrain de dire du BEt) comme le Hoeschst 33258...

Pardon, j'ai plus l'habitude d'en parler en Anglais, le terme exact français ne me revenait pas pour le mineur
Si c'est pour le terme intercalant, je suis tout à fait d'accord, mais tu n'arrêtes pas de parler d'insertion (j'ai juste mis en gras dans ton texte, je n'ai changé aucun mot) ce qui n'est pas la même chose.
La science est une discipline exigeante où on découvre vite qu'une bonne connaissance de la langue française et le respect du vocabulaire permet de mieux comprendre les choses.

Pour ce qui est de la fixation, http://sandwalk.blogspot.com/2007/07...ds-to-dna.html
il semblerait que ce soit par des liaisons Van Der Wall.

[invite5ec2d65d]

Pardon, j'ai plus l'habitude d'en parler en Anglais, le terme exact français ne me revenait pas pour le mineur
Si c'est pour le terme intercalant, je suis tout à fait d'accord, mais tu n'arrêtes pas de parler d'insertion (j'ai juste mis en gras dans ton texte, je n'ai changé aucun mot) ce qui n'est pas la même chose.
La science est une discipline exigeante où on découvre vite qu'une bonne connaissance de la langue française et le respect du vocabulaire permet de mieux comprendre les choses.

je ne vous ai pas fait de remarque ou quoi que ce soit, je m'excuse si je vous ai donné cette impression, je vous ai juste envoyé le passage pour commenter afin d'en tirer une ou deux petites choses en plus c'est tout (d'ailleurs ça vous a permis de vous rappeler de ce mot en français c'est une bonne chose deja ) .

votre message est bien passé, je vous remercie pour vos réponses ça m'oriente au moins dans ma recherche sur ces liaisons.

merci beaucoup et bonne journée.

[invite853321bf]

Mon pardon était sincère pour le mineur, car comme je l'ai dit, l'utilisation des bons mots est importante

Bon courage pour la suite et content d'avoir pu t'aider

[invite5ec2d65d]

Mon pardon était sincère pour le mineur, car comme je l'ai dit, l'utilisation des bons mots est importante

Bon courage pour la suite et content d'avoir pu t'aider

merci beaucoup et honnêtement j'ai toujours trouvé les réponses a mes questionnements dans des articles ou livres en anglais et pas en français.

merci encore une fois.