Dégradation de la cycline D1

[invite22cc3676]

Bonjour,
Dégradation protéasomale de la cycline D1

La progression des cellules eucaryotes à travers le cycle cellulaire dépend de l,activité d'une série de complexes composés des cyclines et des kinases dépendantes des cyclines. La cycline D1 subit une protéolyse dépendante de l'ubiquitine, importante pour conserver son niveau d'expression. La protéolyse des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire dépend largement des ligases Skp1-Cul1-F-box (SCF) et du complexe promoteur de l'anaphase (APC/C). Toutefois, dégradation de la cyclne D1 semble indépendante de ces complexes.

Discutez du rôle de l'ubiquitination dans le contrôle du cycle cellulaire et proposez des approches expérimentales qui permettraient d'identifier la ou les ligases de l'ubiquitine responsable de l'ubiquitination et de la dégradation protéasomale de la cycline D1.
est ce que queslqu'un pourrait me donner des pistes concernant les approches experimentales permettant d'identifier les ligases responsables de la dégradation e la cycline D1?????
plzzzzz c'est très urgenttttt

Merciiii
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[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Une approche possible, et qui avait été réalisée par un estimé collègue est une approche siRNA genome-wide. En Français, cela veut dire que tu éteins l'expression de l'ensemble de l'ubiquinome avec des siRNA et tu regardes l'effet de chaque extinction d'ubiquitine ligases sur la stabilité de la cycline D1 dans des conditions optimales définies au préalable (déprivation en facteur de croissance, stimulation par facteurs de croissance puis déprivation, ou que sais-je encore...).
Une autre approche est d'effectuer une IP anti-cycline D dans des conditions où tu conserve les interactions protéine-protéine. Ensuite tu cribles en spectro de masse les partenaires protéiques de la cycline D1 contre une banque de données à la recherche de séquences correspondant à des ubiquitine ligases.

Voilà déjà pour commencer des idées dans leurs grandes lignes, sans détails. En attendant d'autres suggestions car il existe une foule de méthodes permettant d'identifier de nouveaux partenaires protéiques, comme la méthode de double hybride dont je n'ai pas parlé.

[invite22cc3676]

je vous remercie infiniment pour votre réponse qui m'a éclairé le chemin.
Au fait, j'ai effectué des recherches concernant l'approche isRNA genome wide, pour savoir un peu cmt la mettre en oeuvre. mais j'aimerais bien si vous pouvez me donner de plus amples informations sur la 2eme technique d IP anti cycline D1,
pouviez vous me détailler un peu plus l'approche.
est ce que vous pouvez aussi me communiquer l'expérience réalisée par votre collegue, si c'est possible (j'espere que c publié)
pour la technique double hybride, va permettre de tester l'interaction de la cycline D, avec chaque ligase!

cet examen me stresse enormement, et j'aimerasi bien le reussir, si cela est fait (on croise les doigts), il serait donc mon dernier examen

Merci et Bonne journée

siham

[LXR]

Pour les détails c'est difficile de le faire de façon théorique.

Pour l'IP anti-cycline D1, il faut prendre un anticorps anti-cycline D qui a déjà été publié dans une manip d'IP. Après avoir effectué l'IP, on dénature les billes pour récupérer les partenaires qui ont co-immunoprécipité avec la cycline D. Ensuite on passe ces protéines en spectro de masse ou l'on obtient des spectres de fragmentation qu'on peut cribler contre une banque de données de spectres de masse de protéines. On peut ainsi voir toutes les protéines qui interagissent avec la cycline D. Si une ubiquitine ligase interagit avec la cycline D dans les conditions où on a effectué l'IP, alors un des spectre de masse obtenu correspondra avec le spectre de masse d'une ubiquitine ligase de la banque de données.

Pour le double hybride, on fusionne l'ADNc de la cycline D avec le domaine de transactivation de GAL4, et en parallèle on fusionne les ADNc des ubiquitine ligase connues avec le domaine de liaison à l'ADN de GAL4. Les deux vecteurs sont transfectés dans des levures avec un gène rapporteur sous contrôle d'un promoteur contenant l'élément de réponse de GAL4. Si la cycline D interagit avec une ubiquitine ligase, cette interaction rapproche le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 avec son domaine de transactivation et cela active l'expression du gène rapporteur qu'on peut visualiser (levures bleues si le gène rapporteur code la beta-galactosidase).

L'approche siRNA genome-wide de mon collègue n'a pas encore été publiée désolé.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite22cc3676]

Bonsoir LXR,

Je te souhaite joyeux Noel,
de mon coté je travaille toujours sur le sujet, je doit d'abord expliquer l'ubiquitination des cyclines et son role dans le controle du cycle cellulaire, et expliquer pourquoi la dégradation de la cycline D1 est independante de l'ubiquitination par SCF ouffff bref je profite pas comme il faut des vacances...
si tu trouves certaines references sur le sujet plzz envoie les moi, car j'arrive pas a composer une question précise..
Merry Xmas

S

[invite22cc3676]

Bonjour,

je tente de cloner une sequence a partir d'un transcriptome. j'ai désigné des primers pour pecher ma sequence d'une banque ADNc, j'ai obtenu une bande de la bonne taille. ensuite j'ai rajouté des sites de restriction a mes primers, et là j'obtiens plus rien

pleasee help