Composants d'un vecteur d'expression eucaryote

[invite7b3421a4]

Désolée, 2 messages postés en même temps.
A supprimer
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[invite7b3421a4]

Bonjour bonjour,

En étudiant, j'essaie de répondre aux questions d'examen des années précédantes, mais j'ai un problème et je ne suis pas sûre pour celle-ci :
"Citez les 8 éléments essentiels (nécessaires au fonctionnement) d'un plasmide d'expression eucaryote."
J'ai supposé qu'on prennait un plasmide bactérien, comme souvent pour l'expression dans une levure. Je trouve qu'on a donc besoin de deux origines de réplication, une bactérienne et une eucaryote. D'où ma première question : quel est la fonction de chaque, pourquoi en a-t-on besoin de 2?
Ensuite, on a évidemment notre gène d'intérêt, son promoteur eucaryote, le signal de terminaison de la traduction, les sites de restriction (MCS) et le gène de sélection (auxotrophie le plus souvent ou résistance à un antibiotique). J'en suis à 7 (ou 6 si on compte les ORI pour 1). D'où ma deuxième question, est-ce qu'il faut un site de liaison du ribosome? Autre chose?

Merci de votre aide

[invite9760a8f0]

Il faut 2 origines de réplications pour les vecteurs navettes, c'est à dire pour qu'il se réplique à la fois dans la levure et à la fois dans la bactérie.
J'aurai mis un gène de sélection (un gène de résistance aux antibiotique ou un gène du métabolisme pr la levure) et un gène rapporteur, un promoteur, MCS (un site de clonage multiple). Tu peux mettre le + 1 avec la flèche juste après le promoteur.
Je vois pas quels sont les autres éléments.

[Flyingbike]

peut être un site de polyadénylation ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9760a8f0]

La polyadénylation ça concerne que les ARNm, or un plasmide pour moi c'est de l'ADN circulaire double brin.
tu peux mettre un transposon, mais il y a plus e d'inconvénients que d'avantages.

[Flyingbike]

Merci mais je sais comment ça fonctionne. C'est un vecteur d'expression donc pourquoi vouloir un promoteur et pas de site polyA ?
Il en faut un, le but étant d'exprimer ton gene et la protéine qui va avec (la plupart du temps en tout cas)

[invite9760a8f0]

Honnetement je sais pas. Je suis qu'en L2 biotechnologie. Dans mes cours, quand on parle de vecteurs eucaryotes on a jamais parler de site poly A...
Peut être que quelqu'un d'autres pourra t'aider sur le forum

[invite18dbadb9]

Sans signal de poly-adénylation, pas d'expression il me semble.
+1 Flyingbike
Je ne vois pas très bien ce qu'est ton signal de terminaison de la traduction... un codon stop quoi ? Si c'est ça, pour moi c'est inclus dans ton gène d'intérêt...
Et sinon, on peut parfois trouver un intron dans certains vecteurs d'expression (entre le promoteur et le gène), je crois que ça augmente la capacité d'expression. Mais je ne crois pas que ce soit nécessaire.

[invite7b3421a4]

C'est terminateur de transcription, j'ai confondu
J'ai noté dans mon cours que le signal de terminaison de la transcription est important sinon, comme l'ADN est circulaire, la transcription tourne en boucle ce qui épuise l'énergie. Le signal formerait une structure en forme d'épingle à cheveux.

[invitedcfa2657]

@Angmar: en effet, introduire un intron permet d'augmenter la transcription/traduction via l'épissage.

En fin d’épissage, le complexe EJC reconnaît un des facteurs du spliceosome et reste attaché aux jonctions exon-exon, ce qui permet au mRNA d'être exporté vers le cytoplasme. EJC ne s’associe pas aux mRNA si le gène ne contient pas d'introns. Si on enlève les introns d’un gène on constate que le mRNA est transféré vers le cytoplasme beaucoup plus lentement, d'où l'intérêt d'introduire ne fusse qu'un intron dans le gène à intégrer dans le vecteur

[invite18dbadb9]

Merci pour ces précisions !
Du coup peut-être que c'est ça, sinon je ne vois pas trop...

[invite7b3421a4]

Merci pour toutes ces informations