Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

[inviteab9fd4ae]

Bonjour,
Afin de montrer la localisation préférentielle d'une protéine (noyau / cyto) dans différentes conditions et avec différents mutant de cette protéine, je recherche un protocole permettant de séparer le cytoplasme de la fraction nucléaire. Puis, je visualiserai les niveaux de la protéines en WB. Je sais que cela se fait bien avec des kits notamment le kit Pierce Thermo NE-PER nuclear and cytoplasmic extract reagents. Mais ce genre de kit coûte très cher, ils se moquent de nous, il ne s'agit que de tampons. Je sais que ce type de manip peux de faire des protocole home made. Si une personne aurait la gentillesse de m'éclairer!
D'avance merci!
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[Flyingbike]

il y a la méthode tampon hypotonique/hypertonique (meme principe que NE-PER mais fait maison, mes collègues ont un meilleur rendement).

Si tu me précises de quel matériel tu pars, je pourrais t'aider (cellules, tissus frais, congelés, etc)

[inviteab9fd4ae]

Bonjour,
Merci pour ta réponse.
Je pars de cellules Hela en monolayer....

[Flyingbike]

je peux te passer ce protocole qui marche bien :

extraction de protéines nucléaires v1.pdf

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteab9fd4ae]

Ce protocole est très clair et très simple.
C'est parfaitement ce que je cherchais et je vais m'empresser de tester cela dans les prochains jours...
Un grand merci en tout cas.
je te tiens au courant!
++

[Flyingbike]

héhé c'est moi qui l'ai fait.

Je te précise quand même deux ou trois choses : le truc important, c'est d'arriver a l'étape ou tu mets le tampon hypotonique sur tes cellules sans les abimer. A ce moment, on fragilise la membrane plasmique qui libère le cytoplasme, et donc pour avoir une bonne séparation, il faut absolument réussir a décoller et a rincer les cellules sans trop les malmener.

Si tu as des questions, tu peux me contacter.

[inviteab9fd4ae]

Ok ca marche!
Encore merci!++

[invite0f409d20]

hello
jai besoin d isoler les proteines cytoplasmiques de celles nucleaires est ce que votre protocole marche avec les cellules en suspension
d avance merci bcp

[Flyingbike]

oui il fonctionne très bien, il suffit a la premiere étape de centrifuger les cellules, d'aspirer le milieu et de procéder a la seconde étape.

[invite0f409d20]

merci bien

[invitec706f77b]

Bonjour, et merci pour ce protocole.

Je l'ai suivi à la lettre, mais j'ai une contamination du noyau par des protéines cytoplasmique (GAPDH, actine) . Avez vous des pites pour régler ce problème ?

merci bcp

[Flyingbike]

Hello

Ça fait un bout de temps cette discussion

Quel est votre matériel biologique de départ ?

[invitec706f77b]

He oui, mais ces genres de sujet/probleme sont éternels ^^

ce sont des cellules en culture, plus exactement des macrophages, adhérés en boite de petri

[Flyingbike]

Je n’ai pas de recul sur ces cellules.

Globalement, soit votre lyse initiale n’est pas suffisante, soit vous ne lavez pas assez les noyaux.

Vous pourriez essayer d’augmenter le temps d’incubation dans le tampon A, et/ou augmenter le temps d’agitation avec le Np40, et/ou augmenter le volume de lavage du culot de noyaux (voire laver deux fois)

Ce genre d’optimisation est long et pas simple. Avez vous recherché si des protocoles plus spécifiques à vos cellules étaient disponibles ?

[invitec706f77b]

Merci beaucoup pour ces pistes,
je pense que la lyse est suffisante puisque apres np40, les cellules observées aux microscopes sont "éclatées"
J'ai cherché, mais pas évident à trouver.
Si qqn sait ou il est possible de trouver ce genre de protocole plus spécifique, je suis preneuse !

[Flyingbike]

Vous pourriez montrer un exemple de wb Gapdh ? Pour avoir une idée de l’ampleur.
Avez vous des protéines nucléaires dans la fraction cytosolique ?
Il est généralement plus acceptable d’avoir des protéines cytosoliques dans la fraction nucléaire que des protéines nucléaires dans la fraction cytosolique. Mais ‘cela dépend de ce que vous cherchez. Le 100% de séparation n’est pas possible par des méthodes aussi «*simples*»

Pour les protocoles, ce qui peut fonctionner c’est de poser la question sur researchgate ou protocol online, même si je crois que ce dernier a pris un coup dans l’aile depuis researchgate.

[invitec706f77b]

Ci-joint
La GAPDH est aussi intense dans l’extrait nucléaire que cytoplasmique.
Par contre, pas de protéines nucléaires dans l’extrait cytoplasmique (bon, une expo à 6 min on finit par voir TBP quand même dans l’extrait cyto)
Moi je cherche à voir l’expression préférentielle d’un récepteur dans le noyau et pas sur la membrane cytoplasmique.

[Flyingbike]

Avez vous un autre marqueur ?

La GAPDH peut transloquer dans le noyau dans certaines conditions : apoptose, stress, NO…
Exemple : https://stke.sciencemag.org/content/1/27/ec247

[invitec706f77b]

Oui, je l’ai fait avec l’actine également, même échec !