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Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau



  1. #1
    invite52946466

    Question Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Bonjour,
    Afin de montrer la localisation préférentielle d'une protéine (noyau / cyto) dans différentes conditions et avec différents mutant de cette protéine, je recherche un protocole permettant de séparer le cytoplasme de la fraction nucléaire. Puis, je visualiserai les niveaux de la protéines en WB. Je sais que cela se fait bien avec des kits notamment le kit Pierce Thermo NE-PER nuclear and cytoplasmic extract reagents. Mais ce genre de kit coûte très cher, ils se moquent de nous, il ne s'agit que de tampons. Je sais que ce type de manip peux de faire des protocole home made. Si une personne aurait la gentillesse de m'éclairer!
    D'avance merci!
    ++

    -----

    Dernière modification par mh34 ; 24/04/2018 à 18h44.

  2. Publicité
  3. #2
    Flyingbike

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    il y a la méthode tampon hypotonique/hypertonique (meme principe que NE-PER mais fait maison, mes collègues ont un meilleur rendement).

    Si tu me précises de quel matériel tu pars, je pourrais t'aider (cellules, tissus frais, congelés, etc)

  4. #3
    invite52946466

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Bonjour,
    Merci pour ta réponse.
    Je pars de cellules Hela en monolayer....
    Dernière modification par mh34 ; 24/04/2018 à 18h44.

  5. #4
    Flyingbike

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    je peux te passer ce protocole qui marche bien :

    extraction de protéines nucléaires v1.pdf

  6. #5
    invite52946466

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Ce protocole est très clair et très simple.
    C'est parfaitement ce que je cherchais et je vais m'empresser de tester cela dans les prochains jours...
    Un grand merci en tout cas.
    je te tiens au courant!
    ++
    Dernière modification par mh34 ; 24/04/2018 à 18h44.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Flyingbike

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    héhé c'est moi qui l'ai fait.

    Je te précise quand même deux ou trois choses : le truc important, c'est d'arriver a l'étape ou tu mets le tampon hypotonique sur tes cellules sans les abimer. A ce moment, on fragilise la membrane plasmique qui libère le cytoplasme, et donc pour avoir une bonne séparation, il faut absolument réussir a décoller et a rincer les cellules sans trop les malmener.

    Si tu as des questions, tu peux me contacter.

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  10. #7
    invite52946466

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    Ok ca marche!
    Encore merci!++
    Dernière modification par mh34 ; 24/04/2018 à 18h44.

  11. #8
    lattakia

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    hello
    jai besoin d isoler les proteines cytoplasmiques de celles nucleaires est ce que votre protocole marche avec les cellules en suspension
    d avance merci bcp

  12. #9
    Flyingbike

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    oui il fonctionne très bien, il suffit a la premiere étape de centrifuger les cellules, d'aspirer le milieu et de procéder a la seconde étape.

  13. #10
    lattakia

    Re : Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

    merci bien

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