Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

[inviteab9fd4ae]

Bonjour,
Afin de montrer la localisation préférentielle d'une protéine (noyau / cyto) dans différentes conditions et avec différents mutant de cette protéine, je recherche un protocole permettant de séparer le cytoplasme de la fraction nucléaire. Puis, je visualiserai les niveaux de la protéines en WB. Je sais que cela se fait bien avec des kits notamment le kit Pierce Thermo NE-PER nuclear and cytoplasmic extract reagents. Mais ce genre de kit coûte très cher, ils se moquent de nous, il ne s'agit que de tampons. Je sais que ce type de manip peux de faire des protocole home made. Si une personne aurait la gentillesse de m'éclairer!
D'avance merci!
++

[Flyingbike]

il y a la méthode tampon hypotonique/hypertonique (meme principe que NE-PER mais fait maison, mes collègues ont un meilleur rendement).

Si tu me précises de quel matériel tu pars, je pourrais t'aider (cellules, tissus frais, congelés, etc)

[inviteab9fd4ae]

Bonjour,
Merci pour ta réponse.
Je pars de cellules Hela en monolayer....

[Flyingbike]

je peux te passer ce protocole qui marche bien :

extraction de protéines nucléaires v1.pdf

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteab9fd4ae]

Ce protocole est très clair et très simple.
C'est parfaitement ce que je cherchais et je vais m'empresser de tester cela dans les prochains jours...
Un grand merci en tout cas.
je te tiens au courant!
++

[Flyingbike]

héhé c'est moi qui l'ai fait.

Je te précise quand même deux ou trois choses : le truc important, c'est d'arriver a l'étape ou tu mets le tampon hypotonique sur tes cellules sans les abimer. A ce moment, on fragilise la membrane plasmique qui libère le cytoplasme, et donc pour avoir une bonne séparation, il faut absolument réussir a décoller et a rincer les cellules sans trop les malmener.

Si tu as des questions, tu peux me contacter.

[inviteab9fd4ae]

Ok ca marche!
Encore merci!++

[invite0f409d20]

hello
jai besoin d isoler les proteines cytoplasmiques de celles nucleaires est ce que votre protocole marche avec les cellules en suspension
d avance merci bcp

[Flyingbike]

oui il fonctionne très bien, il suffit a la premiere étape de centrifuger les cellules, d'aspirer le milieu et de procéder a la seconde étape.

[invite0f409d20]

merci bien

[invitec706f77b]

Bonjour, et merci pour ce protocole.

Je l'ai suivi à la lettre, mais j'ai une contamination du noyau par des protéines cytoplasmique (GAPDH, actine) . Avez vous des pites pour régler ce problème ?

merci bcp

[Flyingbike]

Hello

Ça fait un bout de temps cette discussion

Quel est votre matériel biologique de départ ?

[invitec706f77b]

He oui, mais ces genres de sujet/probleme sont éternels ^^

ce sont des cellules en culture, plus exactement des macrophages, adhérés en boite de petri

[Flyingbike]

Je n’ai pas de recul sur ces cellules.

Globalement, soit votre lyse initiale n’est pas suffisante, soit vous ne lavez pas assez les noyaux.

Vous pourriez essayer d’augmenter le temps d’incubation dans le tampon A, et/ou augmenter le temps d’agitation avec le Np40, et/ou augmenter le volume de lavage du culot de noyaux (voire laver deux fois)

Ce genre d’optimisation est long et pas simple. Avez vous recherché si des protocoles plus spécifiques à vos cellules étaient disponibles ?