Bonjour,
Je suis une étudiante, mon sujet de master consiste à muter un codon, lors de la première PCR j'ai pu obtenu mes deux fragments qui correspondent au poids moléculaire calculé pourtant sans insérer mon ADN dans un plasmide (pGEX4T1) mais le problème j'arrive pas à assembler mes fragments même utilisant la "DNA polymerase PFU". A votre avis pour quelle raison l'assemblage ne s'effecutue pas?
Pouvez vous m'aider.
Cordialement.
Salut
te répondre comme ca est super compliqué il peut y avoir 50 raisons qui font que ca ne marche pas, d'autant que tu ne donnes pas beaucoup d'info sur les controles que tu as effectué.
Tout ce que je peux te dire, c'est qu'on utilise en routine le kit "quick-change mutagenesis" (anciennement stratagene) et que pour une mutation ponctuelle notre taux de réussite est de l'ordre de 90%.
YOyo
Salut,
Mon projet consiste à muter 3 codons par double PCR (conversion de UGA à UGG) afin d'exprimer la totalité de la protéine mon problème est: lors de la 1ère PCR j'obtiendrai mes deux fragments souhaités mais lors de l'assemblage par une seconde PCR j'arrive pas à obtenir mon fragment assemblé même en changeant la" taq polymérase" par " pfu dna polymerase", et encore en migrant mon produit de PCR sur gel d'agarose avec la taq je vois une bande qui correspond à mon fragment calculé mais avec la présence des bandes non spécifiques et avec la pfu il n'y a pas eu d'assemblage.
Malheureusement, dans notre laboratoire on utilise pas ce kit. Est ce que vous pouvez m'aider sans proposer l'achat de ce kit
Merci Yoyo pour votre réponse.
