mutagenèse dirigée par pcr

[invite88d94f4d]

bonjour,
j'ai effectué une mutagenèse dirigée par pcr pour modifier trois codons de la séquence de la souche Mycoplasma meleagridis je trouve toujours des difficultés lorsque je mute plus qu'un codon en plus au moment de l'assemblage je trouve toujours des bandes non spécifiques pourtant j'ai modifier les paramètres physiques (température) ainsi que les paramètres chimiques.
Pouvez vous s'il vous plaît m'aider je suis bloquée à cette étape si vous avez des articles ou bien des kits j'ai besoin de plus d'éclaircissement
cordialement,
MKH
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[invitec9f0f895]

Salut

tu utilises un kit en particulier? sinon celui de stratagene "quickchange mutagenesis" est vraiment super efficace.

YOyo

[invite88d94f4d]

bonjour,
merci pour la réponse mais je tiens à vous informer que je vais effectuer une mutagenèse dirigée par pcr à partir d'un fragment d'adn qui n'a pas été préalablement inséré dans un plasmide tel qu'il est mentionné dans le kit pouvez vous me donner plus d'éclaircissement sur ce sujet.
merci
cordialement,
mkh

[invitec9f0f895]

salut

pourquoi tu ne le clones pas?
Sinon tu peux détailler plus ta manip.
YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite88d94f4d]

bonjour,
mon encadreur m'a demandé de ne pas passer par l'étape de clonage préalable, de muter le gène en question par la méthode des 4 oligos et de passer directement à l'étape suivante qui clonage transformation des bactéries compétentes pour exprimer le gène muté, moi aussi je me pose des questions parce que dans tous les articles que j'ai lu j'ai trouvé que les chercheurs ont procédé d'abord à un clonage après ils ont effectué trois pcr successives après ils ont passé à l'étape de transformation des bactéries moi je dois zapper la première étape je n'ai pas osé lui poser la question pour qu'elle raison à votre avis?
cordialement,
mkh