Mutagénèse dirigée

[inviteaac3f9f9]

Bonjour pour un travail sur la mutagénèse dirigée, j'ai besoin de comprendre un texte en anglais. Je ne suis pas très bon en anglais et j'aurais besoin d'un peu d'aide. Voici comment accéder au texte sur le site www.stratagene.com Sur l’onglet «search» de leur page d’accueil, taper le mot quikchange. Dans la fenêtre qui va apparaître, vous allez avoir accès à leur documentation. Trois kits différents vous sont proposés (en vert). Choisissez le «QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit» (il s’agit de la méthode de base) puis cliquez sur le lien Manuals. Parmi les deux choix de manuels qui vont s’offrir, cliquez sur QuikChange® II Site-Directed Mutagenesis Kit, ce qui vous permettra d’ouvrir le manuel d’instructions relatif à la trousse (en format PDF).

J'aimerais savoir le principe de base de la méthode
le rôle des amorces Pfu Turbo DNA Polymerase et DpnI.
Moi je désire muter la séquence GAATTC (EcoRI) en GGATCC (BamHI). Est-ce une mutation possible? Si, oui qu'elles ont les amorces nécessaires, qu'elles seront leur longueur, leur pourcentage en G+C, de mésappariement et le Tm.
Aidez-moi à comprendre SVP
merci
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[invitec9f0f895]

salut

pourquoi ta mutation ne serait pas possible? j'ai l'impression que ton incompréhension ne réside pas uniquement dans l'anglais! Tu sais comment fonctionne une PCR?


YOyo

[inviteaac3f9f9]

Oui, je connais les principes de bases de la PCR. Donc, si moi je veux muter le deuxième site EcoRI dans la GFP pour BamHI, car les 2 sites EcoRI sont au deux l'extrimitées du gène .Est-ce que mes deux amorces seront la séquence de EcoRI et de BamHI? C'est amorces ne sont-elle pas trop courtes?

merci

[Flyingbike]

oui c'est un peu court. Mais pour ce genre de technique tu dois utiliser des amorces contenant la séquence que tu veux modifier, mais aussi une séquence commune avec ta matrice d'ADN. Comme ca l'amorce s'hybride partiellement avec ton ADN, et le reste contient ta mutation.

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteaac3f9f9]

ok, jai tout compris!! J'étais simplement un peu mélangé, mais la ça va. J'ai donc créer deux amorces de 45 nucléotides avec un tm de 80,3, un pourcentage en g+c de 44,4% et un pourcentage de mésappariement de 4,4%.
Merci

[invite8ea281e7]

Je vois que tu as compris comment designer les sondes, je vais rapidement t'expliquer le principe.

Dans un premier temps tu dois insérer ta séquence à modifier dans un plasmide. La Pfu turbo est une polymérase qui fait moins d'erreurs que la Taq. Par PCR, tes amorces contenant les mutations désirées vont être allongées, tu obtiendras ainsi des plasmides "linéarisés" , pareils au plasmide parental mais contenant tes mutations. Apres réaction PCR la digestion à la Dpn1 permet de se débarasser du plasmide parental qui, synthétisé dans une bactérie, est méthylé alors que ceux synthétisés de novo ne le sont pas. La transfo en bactérie permet de un, de liguer les plasmides mutés et de deux de les amplifier.
Il ne te reste plus qu'à espérer voir des clones le lendemain, minipreps et séquençage

[invitec9f0f895]

Je vois que tu as compris comment designer les sondes, je vais rapidement t'expliquer le principe.

Dans un premier temps tu dois insérer ta séquence à modifier dans un plasmide. La Pfu turbo est une polymérase qui fait moins d'erreurs que la Taq. Par PCR, tes amorces contenant les mutations désirées vont être allongées, tu obtiendras ainsi des plasmides "linéarisés" , pareils au plasmide parental mais contenant tes mutations. Apres réaction PCR la digestion à la Dpn1 permet de se débarasser du plasmide parental qui, synthétisé dans une bactérie, est méthylé alors que ceux synthétisés de novo ne le sont pas. La transfo en bactérie permet de un, de liguer les plasmides mutés et de deux de les amplifier.
Il ne te reste plus qu'à espérer voir des clones le lendemain, minipreps et séquençage

Bonsoir

dans le principe c'est tout bon! Maintenant dans le détail, coli ne va pas faire de ligation (la bactérie en est incapable), mais elle va réparer l'ADN transformé (réparation d'une cassure simple brin).

Voila c'etait juste pour préciser la bonne explication de youyouh.

YOyo

[invite8ea281e7]

Merci YOyo