Problème pour l'analyse d'un article
Bonjours à tous, je dois analyser un article scientifique ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12068814 ) qui fait le lien entre hetR et ntcA dans la différenciation des cellules en hétérocyste mais je bloque un peu sur les figures
Part exemple sur celle-ci je n'arrive pas à l'interpréter et à comprendre a quoi servent les nucléotides T G C A sur la gauche?
Comme expérience il s'agit bien d'une extension d'amorce?
Merci par avance pour toute l'aide que vous pourrai me fournir!
Bonjour
Alors j'ai regardé vite fait et je pense qu'il s'agit d'un séquençage par extension d'amorces. Les lettres à gauche sont les 4 oligonucléotides A, T G et C composant la séquence d'ADN et les bandes en dessous indiquent quand il y a un A, un T, un C ou un G dans la séquence. Elle se lit en partant de ton amorce.
a ok, donc une fois qu'on a fait l'extension d'amorce on fait migrer le fragment et pour savoir ou est le +1 on regarde sur les bandes sur la gauche (ou on a séquencer l'ADN) et on regarde dans quel position il se trouve
Euh, en fait lors de ton extension d'amorce tu as plusieurs fragments que tu fais migrer et qui n'ont pas la même taille. Le but c'est d'en avoir un de toutes les tailles afin de reconstituer ta séquence d'origine. En faisant migrer ces fragments tu peux ainsi dire que celui qui migre le plus loin est le plus court et inversement. En marquant avec un fluorochrome différent chacune des 4 bases, tu retrouves ta séquence. Ceci est à confirmer car je mélange peut être deux techniques...
Pr trouver le +1 dont tu parles, il faut trouver l'AUG codon codant pr la méthionine sur le brin sens de l'ADN et ton +1 est le A de l'AUG.
Le point +1 n'est pas la première base du codon d'initiation mais le point de départ de la transcription. Sinon les 5'-UTR n'existeraient pas...Envoyé par Edelweiss68
Bref, pour l'extension d'amorce, on hybride une amorce sur l'ARNm, en 3'.On réalise une reverse-transcription : la polymérisation par une reverse transcriptase (RT) progresse donc vers l'extrémité 5' de l'ARNm. Lorsque la RT arrive à la dernière base, elle ne peut pas aller plus loin bien entendu, elle se décroche donc au niveau de la première base de l'ARNm, qui correspond au point +1 sur la portion d'ADN codant cet ARNm. Le fragment généré par la RT a donc une taille bien déterminée.
On réalise la même expérience sur l'ADNg (même amorce mais avec Taq DNA polymérase) sauf que là on fait un séquençage. Au niveau du point +1, on aura donc un fragment faisant la même taille que le fragment généré par l'expérience de RT. En accolant les gels où on a fait migrer les produits des deux expériences (RT et séquençage), on peut donc voir les bandes qui s'alignent. Il ne reste plus qu'à regarder sur le gel "séquençage" à quelle base il correspond pour connaitre le point +1. Ainsi, en déterminant la séquence en amont et en aval de ce point, on connait sa localisation précise. Toutefois, il ne faut pas oublier de reverse-complémenter la séquence obtenue pour être en présence de la séquence codante, puisque l'extension d'amorce et le séquençage se font sur le brin non codant.
Greg
Dernière modification par LXR ; 21/01/2010 à 23h14.
Re-désolée mais j'ai confondu avec les +1 non officiels que j'attribue au premier nucléotide de chaque codon afin de voir par quelle base (+1,+2 ou +3) commence le début de chaque exon et de pouvoir en déduire un décalage du cadre de lecture ou non en cas de suppression d'exons.
Désolé d'insister sur les termes...
A la place d'exon souligné en gras je verrais plutôt "ORF" non?
Toujours en gras, tu ne voulais pas plutôt dire une suppression de bases. Il est vrai qu'une suppression d'exons peut changer le cadre de lecture d'une ORF en aval de cet exon, mais ce n'est généralement pas ce qu'on recherche de façon "évidente".
Greg
Non je voulais bien dire à la position du nucléotide au début de chaque exon, je ne sais pas ce que signifie ORF (origine de ..??)!
Et concernant la suppression d'un exon, c'est bien ce que je voulais dire, cela résulte souvent de mutation(s) dans un intron soit au niveau de sites donneurs ou accepteurs ou ISE soit entraînant des possibilités de sites donneurs ou accepteurs alternatifs entraînant un "exon skipping".
Et je suis bien d'accord que les mots employés sont importants si l'on veut bien se faire comprendre et surtout essayer de ne pas dire de bêtises!
Je ne comprends pas du tout à quoi te sert de connaitre la position du nucléotide au début de chaque exon...Surtout que vu la notation que tu emploies :
Tout me conduit à penser que tu parles plutôt des différents cadres de lecture possibles.
NB : ORF (Open Reading Frame) : cadre de lecture ouvert. C'est plus rapide que de dire "cadre de lecture"et c'est couramment utilisé.
Greg
Bon et bien ça ne vient pas de moi, c'est la méthode qu'un prof nous a dit de faire (entre autre pr étudier les conséquences hypothétiques sur l'épissage de mutations diverses et variées). Moi j'applique la méthode et en effet cela permet de voir plus rapidemment en cas d'excision d'un exon (mais je radote...) si il y a décalage du cadre de lecture et/ou pas! apparition d'un codon stop!
Jamais entendu parler des ORF, mais je ne suis pas (encore?) en immersion dans le milieu, donc merci pr l'info!
Pas de soucis!Je veux juste que ce soit bien clair.
Je suis étonné que vous fassiez ce genre d'exercice sans connaitre la définition d'ORF. En plus, tu vois les cadres de lecture dans le contexte de ce genre d'exercice, plutôt que de les voir dans un contexte plus général de traduction d'un ARNm avec tout ce que cela implique (région 5'-UTR avant de rencontrer le bon ATG, le bon ATG étant celui qui génère dans la plupart des cas l'ORF la plus longue,...). Je ne remet pas en cause tes connaissances, je suis juste en désaccord avec la pédagogie mise en place pour vous apprendre ce point précis.
Greg
Re : Problème pour l'analyse d'un article
je tiens à vous remercier tout les deux!! j'ai très bien compris la méthode!!!
Je vous embête encore un peu, mais votre avis m'interraissent selon les résultats de cette extension d'amorce, on peut bien voir que
* l'utilisation du tsp en -184 n'est pas régulé par l'azote puisqu'il est présent tout le temps (quelque soit les conditions)
*l'utilisation des 3 autres tsp dépende de la présence en azote
* le tsp -271 n'est pas utilisé dans un mutant NtcA donc son utilisation dépend de la présence de NtcA; de plus ce tsp dépend aussi de HetR (autorégulation? mais il s'active encore plus vous pensez?
*le tsp -696 est indépendant de HetR et NtcA
*le tsp -728 dépend de NtcA
cela suffit comme analyse de la figure??
Merci bcp!!!!!!!!!!!!!!!!!!
