mise au point PCR, RT et QPCR

[cleville]

Bonsoir,
Voilà on m'a demandé de mettre au point ces différents techniques, surtout de les optimiser (afin de faire baisser les coûts des réactions). Nous travaillons sur du végétal (feuilles, cellule épidermiques et racines) et nous faisons de l'expression de gènes en rt-qPCR semi quantitative.

J'ai quelques idées pour la PCR (comme tester différentes Taq, différentes concentrations de Mg2+ sur différents gènes (qui ont différents pourcentage en GC et donc aussi différents primers), tester diverses concentrations en primers (a voir).... actuellement nous utilisons la Red'y'MIX.

Par contre pour la RT (kit biorad), mis a part baisser le nombre d'unité dans la réaction, tester d'autres kit, tester plusieurs concentrations en ARN....je ne sais pas trop et pour la vérifier dois je obligatoirement passer par une PCR? Une qPCR? ou y'aurait -il un moyen de faire différemment?

Et pour la QPCR? Nous travaillons actuellement en SYBRgreen sur 20 uL (kit Brilliant III d'Agilent), baisser la quantité de mix? optimiser la concentration en primers? Je pensais faire ça sur des gènes de rref qui sortent bien tout le temps....Bien entendu on ne doit pas perdre en robustesse

Et l'étape de RT doit être faite dans l'optique de la qPCR.

Merci de votre aide et de vos idées
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[kamor]

Perso je tenterais plus de réduire la quantité de mix que de tester différentes Taq. Le prix fixé dépendra de ton volume de commandes donc c'est difficile comme argument de choix.
Tu peux aussi t'intéresser aux nouveaux fluorophores libres tel que l'evagreen et le syto9 par exemple. Leurs réponses sont plus importantes et donc permettent des volumes plus faibles. Mais bon en dessous de 20µl, c'est quand même peu.
Un autre élément à considérer : le temps. Moins ta PCR dure, plus vous pouvez en faire dans la journée donc plus c'est rentable. Et là pour ça, oui tester les concentrations en MgCl2 et amorces sera valable.

[cleville]

Merci !

Pour la Taq...oui sauf si on arrive a en prendre une moins cher et tout aussi efficace

Pour le temps ce n'est pas (encore) trop un problème, mis a part pour les Qpcr qui tourne en presque en boucle...

des idées pour la RT???

[invite2da41120]

Je suis d'accord avec kamor, descendre en dessous de 20ul de mix en qPCR c'est pas évident! Il y a aussi le mix de Promega (bright Green je crois) qui marche au poil! J'utilise aussi leur reverse, la goscript qui est vraiment moins cher que celle que j utilisais avant si cela peut te donner une piste. Avant j avais un mix tout prêt mais c etait plus cher du coup.

[A voir en vidéo sur Futura]

[cleville]

lhommealaspatule: tu parles du mix de RT?

je vais voir pour les produits, merci

et sinon des idées sur le comment?

[kamor]

Merci !

Pour la Taq...oui sauf si on arrive a en prendre une moins cher et tout aussi efficace

Si vous en faites beaucoup, prendre également de gros volumes genre 10ml plutôt que 1, des petits trucs comme cela. Pareil pour les amorces.

Pour le temps ce n'est pas (encore) trop un problème, mis a part pour les Qpcr qui tourne en presque en boucle...

Là ça peut commencer à chiffrer, l'heure d'utilisation d'un appareil / personnel restera plus cher que ta plaque

Pour le mix, celui ayant Green dans son nom, je parierais pour un kit de PCR Temps Réel plutôt et la Goscript est une RT.
Les kits tout faits sont plus cher mais c'est plus rapidement préparé et on gagne en reproductibilité.

[invite2fb83916]

Hello,
Je pense que c'est au niveau de la RT qu'il faut optimiser (éventuellement faire de la préampification), aussi tu pourras minimiser le volume de cDNA utilisé pour la PCR/qPCR elle même et ainsi éviter les problèmes d'inhibiteurs de PCR...
Pour ma part, j'utilise un appareil Biorad mais les kits de Gene expression assay (custom ou non ) d'Applied. La RT avec préamplification me permet de faire mes qPCR dans un volume final de 7µl.
Je suis bien d'accord avec Kamor, ça coute un peu plus cher, mais au final tu gagnes énormement de temps (mise au point, manips, etc..) et finalement aussi d'argent!

Bon courage!

[invite2da41120]

"lhommealaspatule: tu parles du mix de RT?
je vais voir pour les produits, merci
et sinon des idées sur le comment?"

La reverse de Promega GoScript est 30% moins cher que le mix de Biorad en comparant les deux devis et cela pour le meme nombre de réaction. Apres, c'est sur que l'on perds un peu plus de temps du et la reproductibilité mais bon, soit on fait des économies, soit on en fait pas!