PCR en temps réel (qPCR)

[invite35fbc5ca]

Bonjour tout le monde

J'ai le plaisir de poser mon problème au niveau de ce forum;

Je suis en thèse, et je travaille actuellement sur des qPCR (PCR quantitative) , Sachant que je fais une comparaison relative de l'expression de plusieurs gènes entre plusieurs lignées cellulaires, je vient de calculer via le logiciel associé au Light cycler ce qu'on appele en anglais : the crossing points (qui nous montrent le nombre de cycles necessaires à chaque ADNc pour que sa courbe commence à augmenter). Ma question est de savoir comment procéder pour traiter ces résultats (the crossing points)
Par exemple: le crossing point pour le gène MGP est de 28 dans la lignée cellulaire A, et de 32 dans la lignée B, comment faire le rapport des niveaux d'expression ?
NB: le niveau d'expression de la B-ACTINE dans toutes les lignées cellulaires est le même (crossing point = 20 cycles).

Je vous remercie d'avance pour vos réponse.

Amicalement.
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[kamor]

selon le principe théorique de la PCR, la quantité d'ADN double à chaque cycle. Autrement dit, si entre 2 puits il y a une différence de Ct d'un cycle, on peut supposer qu'il y a 2X plus d'ADN dans un des puits.

Ici tu as 4 cycles d'écart, soit 2^4 = 16. Tu avais donc 16 fois plus d'ADNc avec ta lignée cellulaire A qu'avec la B.

[Flyingbike]

Ce que dis kamor est tout a fait vrai, mais il faut au préalable s'assurer de l'efficacité de la réaction de PCR en réalisant l'amplification sur une gamme de dilutions pour vérifier la linéarité de Ct par rapport a log(concentration)

[invite35fbc5ca]

Bonjour

Je vous remercie d'abord pour vos réponses, cependant, j'aimerais bien signaler que la courbe de fluorescence est exponentielle, donc la quantité d'ADNc augmente via une equation expionentielle, jusqu'à ce que les sites d'action des polymérase soient tous saturés, on passe alors à la partie linéaire de la courbe.

De ce fait, et à mon avis, le calcul des rapport via la methode de 2*2*2...ne peut s'appliquer dans ce cas.

Je vous remercie pour tout commentaire ou solution.

Cordialement.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

si justement dans la phase exponentielle, la progression de l'amplification suit ce schéma (dans le cas ou l'efficacité est voisine de 100%)
D'ailleurs on le vérifie encore une fois a l'aide d'une courbe étalon ou normalement des dilutions en série de 1/2 ont des ∆ct de 1

[kamor]

Théoriquement si tu crées une gamme étalon, le graphe indiquant la relation entre ta quantité d'ADN et le Ct sera de ce type
(valeur absolue) y = 3.32 X+n (valeur absolue)
3.32 étant la racine carré de 10
De plus on ne calcule pas l'augmentation de la quantité d'ADN dans le tube, on calcules le nombre de cycles théoriques qu'il faut pour avoir X quantité d'ADN, qui équivaut à une quantité Z d'ADN initiale, ce qui est légèrement différent.

Pour l'arrêt de la phase expo, l'explication que tu donnes n'est pas la seule.

[invite35fbc5ca]

Re-bonjour

Merci une autre fois pour les réponses à partir desquelles je commence à voir la chose plus claire.

Bonne journée.

[kamor]

De rien.
Pour plus d'informations, j'ai appris énormément de choses dans une review écrite par Kubista et al dans Molecular Aspects of Medicine en 2006, sobrement intitulée "The real-time polymerase chain reaction"

[invite35fbc5ca]

Merci beaucoup.

Bonne fin de journée.