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Passer d'une miniprep à une maxiprep



  1. #1
    kalomnie88

    Passer d'une miniprep à une maxiprep


    ------

    Bonjour à tous, j'ai une question qui je l'avoue peut parraître (et est surement) ridicule...
    Je suis en possession d'une miniprep d'un clone bacterien qui contient un insert qui m'interesse et j'aimerais en faire une midiprep afin d'augmenter le nombre de plasmide que j'ai...
    Le problème qui se pose c'est donc que j'aimerais étaler ma miniprep sur un boite, laisser toute la nuit puis starter et culture dans 50mL LB+amp.
    Je ne sais juste pas quoi étaler sur ma boîte ce soir?
    Est ce que je prend l'Eppendorf qui contient ma miniprep (soit le plasmide purifié) et ca je l'étale sur boite (en zig zag)? Mais ya pas de bactérie la...
    Sinon dois je recommencer ligation, transformation...

    Je sais plus et mon PI est pas la...
    Si vous pouvez me filer un coup de main!
    Merci d'avance

    -----

  2. #2
    kalomnie88

    Re : Passer d'une miniprep à une maxiprep

    Je me suis trompé dans le sujet c'est passer d'une mini a une midiprep...

    Pour que vous compreniez mieux voila ce que j'ai deja fait:
    J'ai purifié un produit de pcr que j'ai essayer d'intégrer par éléctroporation dans des bactéries... J'ai laisser les bactéries pousser toute une nuit sur boite de pétri et j'ai ensuite piqué 22 colonies positive (sélection blanc-bleu) pour vérifié qu'elle contenait l'insert ou non... J'ai donc fait pousser ces 22 colonies dans 3ml de LB+antibio que j'ai laisser pousser toute la nuit.
    Le lendemain j'ai fais une miniprep et j'ai ensuite verifié mes 22 mp par analyse de restriction et il en ressort qu'une seule obtient l'insert.
    J'aimerais donc maintenant faire une midiprep de ce clone pour en avoir un "stock"!
    Je pense donc pour cela étaler de la miniprep sur boite et ensuite repiqué une de ces colonies dans 3ml LB puis faire ma midiprep...
    Je ne sais pas ce qu'il faut étaler sur ma boite de pétri, ce qui me reste de mes 3ml de LB?

    Merci de votre aide

  3. #3
    Guillaume69

    Re : Passer d'une miniprep à une maxiprep

    Salut,

    Si tu étales de l'ADN sur du milieu de culture, il ne va rien se passer, il ne va pas se répliquer tout seul ! Tu vas juste le perdre !

    Pour le moment j'ai fait peu de biomol donc je n'ai jamais été dans ton cas ; mais ce que je ferais à ta place, c'est d'étaler quelques mL (pas les trois, sinon si y'a un problème tu perds tout, un devrait suffir je pense) de LB de ton clone positif pour l'insert, de laisser pousser une nuit, et le lendemain de démarrer une grosse culture en LB pour faire ta midiprep.
    Certains démarrent des cultures liquides à partir de liquide ... Mais pour travailler proprement il vaut toujours mieux d'abord repasser en solide, puis en liquide ; ça permet de vérifier que tu n'as pas eu de contamination.

    PS : Pour conserver des bactéries qui sont dans du LB et éviter toute contamination, il est conseillé de précipiter puis de resuspendre dans du glycérol (30 à 50%). Si tu laisses tes cultures liquides à température ambiante dans le labo, elles vont pas faire long feu.

    PS2 : dans un labo, il n'y a pas qu'un PI. Tu peux demander à des chercheurs / postdocs / techniciens / autres étudiants. C'est toujours plus sûr que de se lancer à l'aveugle ; ils ont peut-être des habitudes de labo/des protocoles que nous n'avons pas.
    On ne te blâmera pas pour avoir posé une question

  4. #4
    Guillaume69

    Re : Passer d'une miniprep à une maxiprep

    Ah et je me suis aussi demandé pourquoi tu dois passer à une midiprep si tu as visiblement réussi à extraire ton plasmide avec la mini...

  5. A voir en vidéo sur Futura
  6. #5
    Flyingbike
    Modérateur

    Re : Passer d'une miniprep à une maxiprep

    si tu as encore de la miniculture que tu as utilisé pour faire la miniprep (celle qui est positive), et qu'elle a été bien conservée, tu peux en étaler un peu sur une boite et mettre le reste dans une culture liquide.

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