Problème de migration électrophorèse (produits bloqués dans les puits)

[invite54b8cadc]

Bonjour,

Je réalise des amplifications single-cell de la zone ITS1-ITS2.
Je dispose de protiste et les amplifications se déroulent correctement sauf ma dernière PCR où, après migration des produits par électrophorèse (gel agarose 1%, 100V, 1h) j'ai eu comme résultats, de nombreux produits apparemment coincés dans mes puits (voir photo jointe). C'est la première fois que j'obtiens de tels résultats avec ces organismes.

J'ai vérifié tous mes produits et ils sont tous corrects. Dans le doute j'ai fait une autre migration avec les produits issus d'une nouvelle PCR et je n'ai eu ce problème que sur un seul échantillon.

J'ai lu divers avis sur ce problème et certains explique ce blocage des produits par une sur-concentration d'ADN dans les puits.
J'ai donc essayé de diluer de moitié ces échantillons purifiés (kit Quiagen) (concentrations entre 50 et 80 µg.ml-1, rapports A 260/280 entre 1.66 et 1.9), mais les produits restent coincés dans les puits.

Est-ce que quelqu'un aurait une explication et/ou une solution pour ne pas avoir à jeter ces échantillons ??

Merci d'avance pour toute réponse
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[Biologiste16]

D'après la photo, on remarque qu`il s'agit bien d'un excès d'ADN dans les puits !!! a mon avis essaye de faire plusieurs dilutions et tu verras .
Ici tu as des smear ce qui explique la diversité des tailles des fragments d'ADN obtenus aprés PCR, je doute aussi qu'il y'est de l'ARN dans ton echantillon !!! si c'est le cas tu devrais peut être faire un traitement avec la RNase et refaire la migration.

[Guillaume69]

Salut,

J'ai moi aussi l'impression que tu as plusieurs problèmes indépendants.

1. Ton ADN bloqué (j'ai pas spécialement d'explication, désolé)
2. Tes smears : des DNAses qui trainent ? De l'ADN de (très) mauvaise qualité ? Une contamination par de l'ARN (y'en aurait quand même beaucoup !)

3. Tes marqueurs de poids moléculaires ne sont pas bons non plus. Normalement tu devrais avoir des bandes très nettes. Tu as même un léger signal au niveau de tes puits, ce qui devrait pas être le cas.
Est-ce que ton marqueur aurait pu subir le même sort que tes échantillons, ou s'agit-il d'un problème indépendant ?
S'agit-il d'un vieux gel, ou d'un gel que tu as laissé se dessécher ? D'une nouvelle boîte / lot d'agarose (qui aurait des problèmes) ?
Est-ce que la cuve de ton electrophorèse est propre ? Quand elles sont pas lavées depuis un moment ça peut créer des problèmes de migration.

Voilà des pistes ... J'espère que tu trouveras le/les problèmes.

[invite54b8cadc]

Bonjour,

Merci pour ces deux réponses.
Je vais tester tout ça maintenant

[A voir en vidéo sur Futura]

[Guillaume69]

Du nouveau ?

[invite235fb775]

salut j ai un petit rapport concernant notre TP en biomoléculaire , J aimerais que vous me disiez ce que vous en penser en laissant vos commentaires ! Merci

[invite54b8cadc]

Bonjour,

J'ai testé plusieurs choses après vos conseils (lavage de la cuve entre autre). J'ai changé de ladder et je n'ai plus le problème rencontré pour la migration du ladder.
Cependant, malgré plusieurs dilution des produits PCR bloqués (1/2, 1/4 et 1/8) je n'ai pas réussi à faire migrer ces produits. Il ne s'agit pas de l'agarose puisque sur le même gel j'ai des produits qui migrent (d'une autre PCR) et ceux qui bloquent qui ne migrent pas...
Du coup je ne vois pas trop ce que je pourrais faire pour débloquer ces produits... je pense qu'il y a eu un problème avec le mix PCR puisque depuis ce temps j'ai refait d'autre PCR avec les mêmes produits de base (H20, dNTPs, etc...) et j'ai eu de bons résultats...

Cordialement

[Yoyo]

Salut

On dirait que ce sont des débris cellulaires qui restent coincés dans le puit!

Yoyo

[invite54b8cadc]

Bonsoir,

Le même problème vient d'arriver une nouvelle fois sur d'autres échantillons...
Notre dernière hypothèse concerne le thermocycleur qui pourrait avoir une défaillance. En effet, en utilisant exactement le même cycle, les mêmes composants pour le mix PCR (sauf bien sûr les échantillons) j'arrive à deux PCR faites en 24h de délai, et une PCR a marché et l'autre non... De plus, en utilisant le même témoin positif (même tube) sur les deux PCR, dans un cas il y a un signal sur le gel, dans l'autre cas non... Enfin, cela ne vient pas du gel, ni du tampon, ni du loading dye vu que sur ma dernière PCR, le ladder a correctement migré tout comme un échantillon issu d'une PCR précédente ayant marché...

Cordialement

[jugen]

Bonjour,

J'ai le même soucis que vous, on dirait que mes produits PCR restent bloqués dans le puit. Nous avons essayé de les diluer sans résultats. Sur une même PCR on peut avoir des échantillons qui fonctionnent normalement et d'autres où le problème survient... on ne sait trop quoi pensait ... on n'a même refait un gel en changeant le tampon de migration mais toujours le même soucis pour les mêmes échantillons...

Vous avez réussi à résoudre le problème depuis ?

Merci d'avance