Exercice de biologie moléculaire

[invitedb45f0cd]

Bonjour,

J'ai un exercice à faire qui demande de trouver le bon vecteur pour produire une protéine dans les bactéries.
J'ai le choix de trois vecteurs: pBR322
pGL2
PinPoint Xa-1

À date, j'ai trouvé que ça ne peut pas être pGL2 puisqu'il est spécifié pour les eucaryotes puisque ce vecteur fait la polyadénylation du transcrit avec SV40.

Et entre pBR322 et PinPoint Xa-1: Les 2 sont spécialisés dans les procaryotes.
PinPoint Xa-1 a un promoteur RBS T7, a le gène de résistance à l'ampicilline donc possède la séquence de B-lactamase.
pBR322 a le gène de résistance à l'ampicilline (B-lactamase aussi) et à la tétracycline.

Je ne sais pas quoi regarder pour comprendre si c'est PinPoint Xa-1 ou pBR322

Merci, je mets mon document en pièce jointe pour plus de précision
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[piwi]

Bonjour,

Avez vous lu la doc associée à votre énoncé? La réponse est écrite en toute lettre dedans.
Pour vous aider, on peut dire ceci:
pBR est un vecteur de clonage
pGL2 est un vecteur permettant d'analyser l'activité promotrice/régulatrice d'une séquence
pInPoint est un vecteur d'expression

Si avec cela vous n'avez pas votre réponse qui vous saute au nez, c'est que vous avez un gros problème en biomol et que vous devriez revoir vos cours sur les vecteurs.

Cordialement,
piwi

[invitedb45f0cd]

ahhh oui d'accord !

merci piwi

[invite49a79edb]

Quelq'un a t-il comprit ses 2 numéros :

1- Vous désirez ensuite créer une souris transgénique qui exprimera cette protéine en fusion avec
la protéine GFP. Vous devez donc introduire dans des cellules ES un transgène contenant la
séquence de GFP et la région codante de votre nouvelle protéine en phase, et sous le contrôle d’un
promoteur. Pour créer votre ADN recombinant, vous devrez utiliser le site EcoRI (GAATTC) présent
à la fin de la séquence GFP dans votre vecteur. La fin de la séquence de GFP est représentée
ci-dessous. Les triplets vous indiquent le cadre de lecture:
...TCC GGC CGG ACT CAG ATC TCG AGC TCA AGC TTC GAA TTC TGC ...
Proposez une amorce de 20 nucléotides incluant le site EcoRI qui vous permettra, avec une
autre amorce antisens (non montrée), d’amplifier spécifiquement la région codante pour l’insérer
dans cette construction en phase avec GFP.
Réponse:...

2- Une fois inséré dans le génome de la souris, cette construction donnera une protéine chimérique
GFP-X. Pour que cette protéine s’exprime spécifiquement dans les fibroblastes, par exemple,
la séquence transgénique devra être insérée à proximité de séquences régulatrices dirigeant
l’expression dans les fibroblastes. Expliquez comment l’expression du transgène peut être guidé
par le choix du promoteur et des séquences régulatrices.

Réponse: ...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitedb45f0cd]

haha ! es-tu en bio à l'udem ?!

J'ai regardé ce que le prof avait fait à l'atelier 7, et j'ai essayé de trouver une séquence atg dans l'ADNc.
Et j'ai juste ajouter EcoRI en avant de ma séquence...

Par contre, je ne suis vraiment pas une source fiable !

[piwi]

Et c'est faux...
Les enzymes de restrictions sont des endonucléases. Si vous n'ajoutez que le site de restriction, il se retrouve à l'extrémité de la séquence et l'endonucléase ne coupera pas. Il faut ajouter 5-6 nucléotides supplémentaires pour donner une assise à l'enzyme afin qu'elle puisse couper. (Je n'ai pas vu tout l'exercice, je ne préjuge pas qu'il n'y ait pas d'autres erreurs)

piwi

[invitedb45f0cd]

En effet, j'aurais mis par exemple GAGA avant mon enzyme de restriction, mais le professeur a dit de ne pas l'inclure dans la séquence de 20 nt a donné

[piwi]

Il y a encore un point à ne pas négliger. Vous avez une séquence codante dont vous ignorez la phase de lecture. Il faut donc screener cette séquence dans les trois phases pour trouver la phase ouverte qui doit être la bonne. Une fois que vous aurez trouvez cette phase, vous prenez les 14-20 premiers nucléotides, vous mettez devant votre séquence de restriction, et encore devant 6 nucléotides pris au hasard. Et voilà l'idée.

Cordialement,
piwi

[invite49a79edb]

Excusez moi monsieur piwi je me demande vous voulez dire quoi par screener !!!! Sinon comment pourrai-je identifier le cadre lecture, puisque la sequence d'ADN est longue.

Merci.

[invite49a79edb]

sinon après avoir identifier le cadre de lecture avec ATG est ce que je dois inclure ce qui est en arrière de cette séquence ou commencer à partir de ATG.

[piwi]

En cherchant les codons stop. Le cadre de lecture ouvert ne doit pas en contenir, les autres si. Vous pouvez le faire à la main ou utiliser un outil informatique genre http://web.expasy.org/translate/
Il n'y a effectivement qu'une frame ouverte.

Cordialement,
piwi

[invite49a79edb]

chez les eucaryotes, une séquence consensus optimale qui définie à partir de quel ATG on débute le cadre de lecture. Est ce que sa pourrait avoir rapport dans ce cas-ci sachant qu'on exprime cet ADNc chez les souris transgénique !!

[invite1ad873a8]

je peux connaitre la réponse pour la premiére question: quel est le plasmide que vous avez choisi??

[piwi]

Il commence à y en avoir assez de cette question! La réponse est dans la documentation qui vous a été fournie, vous n'avez qu'à la lire.

Cordialement,
piwi

[invite1ad873a8]

c bn... euh..dsl

[invitee431189c]

lol bon j'imagine que nous suivons tous le même cours!
Pour ce qui est de la question "Expliquez comment l’expression du transgène peut être guidé
par le choix du promoteur et des séquences régulatrices." tout ce que j'ai trouvé c'est que le promoteur aide à spécifier dans quel tissu la protéine sera exprimée et que les séquences régulatrices vont permettre d'amplifier ou d'inhiber la transcription selon les besoins de la cellule.....
Mais je n'ai pas l'impression que ma réponse est complète.... Suis-je du moins sur la bonne voie??Sinon avez-vous des pistes à me donner?

Merci infiniment

[piwi]

Le promoteur d'un gène spécifique d'un type cellulaire fera que le transgène ne s'exprimera que dans ce type cellulaire. C'est un bon point.
ensuite, il existe des séquences de régulation qui vont pondérer l'expression du transgène.
Sur ce point, vous avez parfaitement raison, rien à redire. Ensuite, on peut aller un peu plus loin dans l'explication. Certains éléments de régulation vont permettre la fixation de facteurs de régulation spécifiques et rendre le transgène dépendant de certains conditions (présence d'éléments particuliers [voir opéron lactose], ou encore thermoinductiblité, etc...).

Cordialement,
piwi

[invitee431189c]

d'accord je vois! Merci encore pour votre aide!!