PCR, taux d'expression de la β-actine

[invite0d3258c2]

Bonjour
Je fais des PCR en ce moment et j'ai des soucis avec mes résultats. Je travaille sur les cellules HepG2 que je traite avec differentes drogues. Le problem c'est que d'une manip à l'autre, malgré un meme traitement , le taux d'expression de la β-actine varie énormement. Ma chef pense que ce n'est pas normal. D'apres elle, ce taux d expression devrait etre à peu pres le meme dans chaque manip, car selon elle, le taux d expression de la β-actine ne varie pas , meme suite a un traitement. Qu'en pensez-vous ? D'ou peut venir mon erreur ? Je ne suis pas bio Mol, alors tous vos conseils sont les bienvenus. Merci d'avance
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[invite02e16773]

Il arrive que la b-actine pose problème.
Je ne sais pas si ça vient du gène ou des primers généralement utilisés (souvent Roche pour les qPCR), mais ça arrive, pour différentes manips et dans différents labos. Dans mon cas j'avais un ou des produits d'amplifications non spécifiques, ce qui affectait le Cp. C'est ton cas ?

Personnellement j'ai changé de gène de référence (HPRT) et tout s'est bien passé ensuite.

Sinon, ça peut aussi vouloir dire que ton traitement joue sur la b-actine. C'est pour ça qu'il vaut mieux tester plusieurs gènes de références et prendre celui qui varie le moins.

[Flyingbike]

désolé guillaume mais je vais devoir me fâcher un peu


On ne choisit pas un gène de ménage parce qu'il ne varie pas. C'est totalement arbitraire, et à la limite si on prend soin de choisir un gène qui ne varie pas, pourquoi diable vouloir normaliser quoi que ce soit ?

On doit choisir un gène de ménage parce qu'il n'est pas sensé varier (et ce n'est jamais vraiment le cas).

D'ailleurs, quand on travaille très proprement, on peut avoir de très bons résultats sans normaliser, simplement parce qu'en préparant ses ARN, sa RT, ses dilutions et tout, on part sur une quantité d'ADNc connue et identique pour tous les échantillons.

[invite02e16773]

Fâche-toi, tu peux si je dis n'importe quoi :]

Je me suis peut-être mal fait comprendre.
Ce que je voulais dire, c'est que quand on met au point une qPCR et qu'on a le choix entre différents gènes de ménages (= différents gènes qui ne sont pas censés varier, je suis ok avec ça) lorsque l'on utilise telle drogue/anticorps/traitement sur ses cellules par exemple, on prend soin de tester avant que c'est bien le cas (ou plus ou moins le cas)...

Sinon, si le gène voit sa régulation être drastiquement affectée par le traitement qu'on utilise (parce qu'il est en aval d'une cascade de signalisation à la drogue par exemple), il ne peut plus être un gène de ménage. Tu n'es pas d'accord avec ça ?

mais vraiment, je pense que la raison la plus "simple" pour expliquer de telles variations est un problème de primers/amplification

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0d3258c2]

Bonjour et merci pour vos réponses. Je suis désolée pour la réponse tardive, mais je viens juste de rentrer.
La discussion reste ouverte. Je relancerai le débat dès que je me serai posée. Merci encore