[Microbiologie] western blotting
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western blotting



  1. #1
    invite88d94f4d

    western blotting


    ------

    bonjour,
    j'ai fait migrer mes protéines par sds page en puits confondus, sur le gel les bandes sont nettes, en faisant le transfert sur membrane de nitrocellulose et après révélation par le 4 chloro1 naphtol je n'ai pas obtenu des bandes pourquoi à votre avis sachant que le transfert s'est bien passé j'ai dilué les anticorps primaires 1/100 et les anticorps secondaires 1/2000 je doute par rapport au titre des anticorps que j'ai utilisé sachant qu'ils proviennent des patients atteints de Mycoplasma pneumoniae qu'est ce que je dois faire?
    cordialement,
    mkh

    -----

  2. #2
    piwi

    Re : western blotting

    Comment savez vous que le transfert c'est bien passé? Parce que le ladder était clair?
    Pour avoir une idée de la quantité de protéines sur la membrane vous pourriez la passer au bleu colloidal (ou bleu de coomassie). Vous pouvez essayer aussi l'amidoblack si vous ne souhaitez plus utiliser la membrane ensuite.
    Ensuite, si vous n'avez aucune idée du titre des anticorps, et de leur qualité, il va être difficile de faire autre chose que d'essayer d'autres dilutions. Les anticorps perox ne sont pas très stables (c'est l'enzyme qui se dégrade), vous pourriez utiliser un autre lot, neuf, ou tester ce secondaire avec un anticorps primaire dont vous être certain(e).

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  3. #3
    invitec9f0f895

    Re : western blotting

    salut

    le mieux serait de faire migrer en parallele un échantillon positif dans lequel vous etes sur de devoir observer un signal.
    Le rouge ponceau est aussi pratique pour vérifier qu'il y a bien des protéines sur la membrane, les étapes de blocages peuvent parfois etre problématiques. J'ai parfois observé qu'un blocage plus court améliorait les signaux.

    Yoyo

  4. #4
    invitec9f0f895

    Re : western blotting

    salut

    le mieux serait de faire migrer en parallele un échantillon positif dans lequel vous etes sur de devoir observer un signal.
    Le rouge ponceau est aussi pratique pour vérifier qu'il y a bien des protéines sur la membrane, les étapes de blocages peuvent parfois etre problématiques. J'ai parfois observé qu'un blocage plus court améliorait les signaux.

    Yoyo

  5. A voir en vidéo sur Futura
  6. #5
    invite88d94f4d

    Re : western blotting

    merci pour votre collaboration
    mkh

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