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Dosage de la phosohatase alcaline d'un sérum



  1. #1
    MasterCobra

    Dosage de la phosohatase alcaline d'un sérum

    Bonjour à tous,

    Je fais un laboratoire sur le dosage de la phosphatase alcaline. Le substrat de cette réaction est le "para-nitrophényl phosphate" qui se fait hydrolyser par l'enzyme en "para-nitrophénol" qui est de couleur jaune, qui se fait doser par spectrophotométrie.

    Après la préparation d'une courbe standard de PNP, qui détermine la densité optique de différentes solutions de PNP, il est possible de doser l'enzyme d'un sérum.

    Dans deux tubes différents nous mettons du substrat alcalin en excès. On les incube 5 mins à 37oC. Ensuite, dans le tube "blanc", on ajoute de l'eau et dans le tube "test" du sérum, qui contient l'enzyme à doser.

    Les deux tubes sont passés au spectro à 410nm pour une 1e lecture. Cette lecture tient compte de l'enzyme présente et du PNP, qui est jaune. En ajoutant du HCl, la solution perd sa coloration jaune et devient incolore. En repassant au spectro, la 2e lecture tient compte seulement de l'enzyme, vu que le PNP n'est plus un facteur. En soustrayant les deux DO, on obtient la DO du PNP seulement, qui est ratachable à la courbe standard. On peut alors déterminer la concentration de PNP dans notre tube.

    Voici mon questionnement:

    Comment la concentration de PNP est liée à la concentration d'enzyme? Est-ce que la concentration calculée de PNP est égal à la concentration d'enzyme? Si mes calculs arrivent à une concentration de 0,0382 mM de PNP, est ce que la concentration d'enzyme est également égal à 0,0382 mM?

    Et comment on transforme cette concentration de mM en unité international d'enzyme?

    Merci,
    Julien

    -----


  2. #2
    MasterCobra

    Re : Dosage de la phosohatase alcaline d'un sérum

    Évidemment, les lectures au spectro se font après incubation... 30 mins d'incubation de l'enzyme avec substrat à 37oC

  3. #3
    MasterCobra

    Re : Dosage de la phosohatase alcaline d'un sérum

    Une autre question... après l'incubation, on ajoute 9,9 mL de NaOH 0,02N, pour stopper la réaction. En quoi cette ajout stoppe la réaction? Est ce que le NaOH dénature l'enzyme? j'en doute, parce que l'enzyme fonctionne en milieu alcalin...?

    Merci

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