Purification d'un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose

[invite2475de1a]

Salut tout le monde ;

Merci de bien vouloir m'aider car je suis vraiment dans une impasse

Dans le cadre de mon mastére, je me propose de purifier un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose ,l'anticoprs j aurais à l utilisé pour une chromatogrphie d'affinité pour purifier une proteine periplasmique.

Donc en gros, je fais migrer un echantillon contenant la proteine toxoplasmique P30 par SDS-PAGE puis aprés transfert , saturation et incubation avec un serum (à purifier) je coupe une portion de la membrane qui correspond a la proteine d interet et j utilise un tampon d elution pour eluer les anticorps a partir de la membrane.

j ai utilisé un tampon d elution acide : tris glycine ph 2.6
et un tampon basique : tris base ph 11.3

jai verier les perides d incubation et jusque la j ai pas eu vraiment une bonne elution les anticorps restent plutot fixé sur la membrane.

J espére ke parmi vous y aura ceux qui ont eu affaire à ce genre d'elution pour pouvoir me guider.
je vous remercie d avance
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[Chewee]

Salut tout le monde ;

Merci de bien vouloir m'aider car je suis vraiment dans une impasse

Dans le cadre de mon mastére, je me propose de purifier un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose ,l'anticoprs j aurais à l utilisé pour une chromatogrphie d'affinité pour purifier une proteine periplasmique.

Donc en gros, je fais migrer un echantillon contenant la proteine toxoplasmique P30 par SDS-PAGE puis aprés transfert , saturation et incubation avec un serum (à purifier) je coupe une portion de la membrane qui correspond a la proteine d interet et j utilise un tampon d elution pour eluer les anticorps a partir de la membrane.

j ai utilisé un tampon d elution acide : tris glycine ph 2.6
et un tampon basique : tris base ph 11.3

jai verier les perides d incubation et jusque la j ai pas eu vraiment une bonne elution les anticorps restent plutot fixé sur la membrane.

J espére ke parmi vous y aura ceux qui ont eu affaire à ce genre d'elution pour pouvoir me guider.
je vous remercie d avance

Vous tentez de faire ce qui est appelé un stripping, pour ma part j'en réalisé quelques un. Mon protocole était similaire à celui là:

http://www.abcam.com/ps/pdf/protocol...0reprobing.pdf

Il est conseillé d'utilisé du PVDF plutôt que la nitro...

Une question me taraude: vous voulez purifier des Ac pour les utiliser dans une colonne d'affinité. Mais selon votre procédure utilisant une sélection sur SDS-PAGE ne risquez vous pas de sélectionner des anticorps qui ne reconnaitrons pas la structure 3D de votre protéine? Ce qui risquerait de poser quelques problèmes quant au rendement de votre purif par affinité sur colonne...

[invite2475de1a]

Merci bp pour l 'aide

en fait pour repondre a ta question, j utilise l'electrophorése dénaturante car ma proteine precipite en gel natif c'est une question de pHi.
Dans le periplasme de Ecoli se trouve ma proteine d interet la p30-AP (proteine de fusion couplée a la phosphatase alcaline et la phosphatase endogéne ) la p30 a un phi de 6 et la AP de 4.5. Aprés plusieurs essai j ai pu separer la p30-AP de la AP endogéne ce qui est deja pas mal mais la p30 precipite en natif et reste a la base du puit.Comme j ai besoin de la separer des autre molecules pour realiser le stripping je ne peut travailler kon denaturant.
Ceci dit vous avez raison, le serum riqsue de ne pas bien reconnaitre la forme denaturé c 'est a verifier.