Purification sur colonne échangeuse d'ions

[Yoyo]

Bonsoir,

Une question à ceux qui font de la purification de protéine sur colonne (dans mon cas une FPLC).
Je fais une premiere purification de ma protéine taggée sur Ni2+ que j'élue à l'immidazole. Jusque la tout se passe bien.
Ensuite je dépose les fractions d'intéret sur une colonne monoQ et c'est la que ca se complique... rien n'est élué de la colonne meme a 1M de NaCl!
Mon sentiment est que la protéine ne s'y accroche pas. POurtant les pH des tampons ont été vérifiés ils sont bien > au pHI donc la protéine doit bien etre chargée négativement.

Du coup je me demande si la présence d'immidazole ne gène pas. On m'a dit que non, qu'il était possible de purifier en sortie de colonne Ni mais j'ai comme un doute maintenant

Si certains ont l'expérience de purification sur monoQ, merci d'avance pour vos avis.

Yoyo
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[Pfhoryan]

Ensuite je dépose les fractions d'intéret sur une colonne monoQ et c'est la que ca se complique... rien n'est élué de la colonne meme a 1M de NaCl!
Mon sentiment est que la protéine ne s'y accroche pas.

Tu ne peux pas vérifier si ta protéine est passée à travers?

[Yoyo]

Tu ne peux pas vérifier si ta protéine est passée à travers?

On a tenté mais rien de convainquant... maintenant j'ai du mal à croire qu'a 1M de NaCl la protéine ne se décroche pas.

Yoyo

[piwi]

Salut,

J'ai déjà eu à étudier des interactions protéiques tellement fortes que même 1.5M NaCl n'étaient pas suffisant pour dissocier les deux protéines. Alors après tout...
Bon, maintenant, c'est vrai que c'est une purif' sur une colonne. C'est un peu étonnant. Ce que tu peux faire, foutu pour foutu, c'est de faire bouillir un peu de ta résine chargée pour vraiment être certain de tout casser et de tout décoller. Ensuite, zou, dans un gel pour voir ce qu'il y a là dessus (en WB ou en simple coomassie/bleu colloidal).

piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[Pfhoryan]

On a tenté mais rien de convainquant... maintenant j'ai du mal à croire qu'a 1M de NaCl la protéine ne se décroche pas.

Oui 1 M c'est beaucoup. Mais comment suis tu ta protéine durant la purif? Pas d'activité?

[Yoyo]

Oui 1 M c'est beaucoup. Mais comment suis tu ta protéine durant la purif? Pas d'activité?

Non pas d'activité facilement détectable. On la suit par absorption à 280nm et apres on confirme sur gel et coloration au nitrate d'argent.

YOyo