Bandes non spécifiques en Western blot

[invite573f7f25]

Bonjour à tous,

Voilà, j'ai un petit problème de western blot (Photo ci-dessous à la fin du Message). J'ai effectué avec les même échantillons (lysats d'HAEC pour les 5 premiers puits; Thp1, Monocyte, Macrophage pour les trois dernier puits) deux western blot différents.

Le premier avec un Ac primaire (AC1) à 1:200 (concentration initial 200ug/ml), et un secondaire anti-goat à 1:10000 (concentration suggérée 1:2000)

Le deuxième avec un Ac primaire (AC2) à 1:1000 (concentration initial 1mg/ml), et un secondaire anti-rabbit à 1:20000

Les deux anticorps reconnaissent des protéines différentes, les anticorps secondaires sont différents et pourtant sur chacun de mes gels j'ai des bandes apparemment non spécifique (à 60kDa environ) et exactement identiques d'une membrane à l'autre.

Quelqu'un saurait-il à quoi cela pourrait correspondre....?

A noter malheureusement l'absence de bande spécifique sauf dans le deuxième gel à 16kDa avant dernier puits (monocytes).
De plus l'exposition est très forte, 1,5s au lieu des 400ms que j'utilise d'habitude.

Merci par avance pour votre aide!


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[Flyingbike]

je ne suis pas un expert avec les cellules que tu utilises, mais a chaque fois il faut penser a ce que pourrait reconnaitre le secondaire. C'est un anti IgG je suppose, et il me semble que les IgG migrent a peu près à cet endroit la... peut être une cross réaction entre l'anticorps secondaire...

[invite71f23525]

Est-ce que tu as déstrippé ta membrane entre les deux anticorps? Car bizarrement, la bande à 60 kDa a exactement le même profil sur les deux photos, comme si tu avait fait un déstripping qui avait mal marché.

Quel est ton système de révélation car pour moi 1,5 s d'exposition c'est extrêmement court? Caméra CCD (pour faire 400 ms, ce doit pas être des hyperfilms! )?

[invite573f7f25]

Re!

Alors le coup de la chaine lourde des IgG me parait être la bonne explication pour expliquer ces bandes non-spé!

Pour ce qui est du stripping il n'y en a pas eu puisque je n'ai fais qu'un Ac primaire par membrane. Ce qui me surprenait c'était d'avoir les même bandes non spé avec des Ac primaire et secondaire complétement différent pour chaque membrane.

Pour ce qui est de mon système de révélation : membrane PVDF, ECL plus (GE-Healthcare) pendant 3 min, puis je passe ça à l'ettan DIGE imager.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

OK pour l'identification du problème des bandes non spécifiques (toutefois, je ne vois pas cela très clair car généralement si on détecte des bandes à la taille de la chaine lourde des IgG, c'est qu'on a effectué une IP avant le dépôt sur gel, chose que tu n'as visiblement pas fait avant...), mais ton réel problème est que tu n'as pas de bande spécifique. A priori les bandes non spé on s'en fout un peu du moment qu'elles ne sont pas collées aux bandes spécifiques...As-tu une idée pour détecter les bandes spécifiques?