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Comparaison de plaque qPCR



  1. #1
    Voragine

    Lightbulb Comparaison de plaque qPCR

    Ah j'vous spamme avec la PCR hein !

    Alors j'ai 6 plaques de qPCR, 2 par espèce recherchée (protozoaire, bactérie ou champignon), sur chacune se trouve 3 échantillons de références toujours placés au même endroit et issus des même aliquots.
    Pour tous mes échantillons j'ai obtenu le nombre de CT et MT, je cherche maintenant à savoir si je dois appliquer un facteur de correction aux valeurs que j'ai obtenu.
    En effet, les valeurs de CT et MT entre mes plaques (pour une même espèce toujours) de mes échantillons de références diffèrent légèrement, j'aimerai donc savoir comment je peux tenir compte de cette différence et la reporter sur mes autres valeurs ?
    Dois-je faire la moyenne des valeurs de chacune des plaques ? Calculer le nombre de CT d'écart et appliquer cette différence aux autres valeurs ?

    Mon but final étant de calculer le nombre de copie de mon gène, grâce aux CT, j'applique donc un traitement statistique, j'ai besoin de valeurs précises.

    J'espère que je suis compréhensible, ce n'est pas d'une incroyable facilité à décrire...

    -----


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  3. #2
    bob.razowsky

    Re : Comparaison de plaque qPCR

    Salut Voragine,

    J'ai une premiere question:

    Fais tu de la quantification relative ou absolut pour l'expression de tes genes?

    Classiquement on fait de la quantification relative. La méthode que nous utilisons dans notre labo est celle qui est décrite dans ce papier:

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?t...ng%20real-time

    Tu dois avoir des gènes des référence parmi les couples de primers que tu as utilisé. Le principe est que pendant la RT, tu as utilisé une quantité (à peu près) connue d'ARN. Or tu ne peux pas être sur que la RT s'est déroulée identiquement dans tous tes échantillons.
    Donc des gènes, dit de "ménage", sont utilisés comme contrôle. Ils sont sensés être toujours exprimés de la même manière chez une espèce, quelque soient les conditions.

    Le principe est de rapporter le Ct du gène que tu veux voir bouger au Ct du gène de ménage. C'est ce qu'on appelle le "delta"Ct. On le représente en histogramme sous la forme de 2^-"delta"Ct.
    La seconde étape (que tout le monde ne fait pas forcement) est de rapporter la première différence au Ct de la condition expérimentale témoin. C'est ce qu'on appelle de "delta""delta"Ct. Il est représenté en histogramme en 2^-"delta""delta"Ct. Souvent on le passe en log(2).

    Tu as toute cette théorie expliquée en détaille dans le papier que j'ai mis en lien. C'est un peu plus compliqué que ce que j'ai décrit si tu prend en compte tous les paramètres, mais globalement c'est le même principe.

    Bonne chance et bon courage, je me souviens de ma première qPCR et c'était terrible.

    Bob

  4. #3
    Voragine

    Re : Comparaison de plaque qPCR

    Je travaille en absolu !

    On cherche à quantifier des communautés dans une matrice assez chargée, avec des amorces universelles.
    Mes échantillons de références subissent eux aussi le traitement PCR, ils sont là pour valider le fait qu'entre 2 plaques il se passe la même chose. Je ne suis pas dans le calcul direct de mes CT/nb de copie, j'essaie de mettre au même niveau mes plaques, parce que je ne peux pas travailler exactement de la même manière entre deux plaques, donc je dois corriger mes valeurs. Ma question c'est comment puis-je faire ça ?

    Oui ce sont mes premières qPCR ! J'ai fini par arriver à m'en sortir, mais que les débuts ont pu être difficiles...

  5. #4
    bob.razowsky

    Re : Comparaison de plaque qPCR

    La seule personne que je connaisse et qui ai fait un peu de la quantif absolut m'a dit s'être contenté d'appliquer un facteur de correction en fonction de la quantif des temoins...

    Regardes dans la biblio si tu peux trouver davantage d'info...

    Désolé

    Bob

  6. #5
    Voragine

    Re : Comparaison de plaque qPCR

    C'était justement comment calculer le facteur de correction qui m'intéressait !
    Enfin j'ai trouvé, je procède comme suit:
    Je récupère les MT de chaque référence pour les plaques selon l'espèce recherchée, puis je calcule le CT moyen de chaque référence, je trace ensuite une courbe Ct observé en fonction du Ct moyen et grace à l'équation de chaque droite, j'obtiens une correction que j'applique sur tous les echantillons de ma plaque

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    edhelia

    Re : Comparaison de plaque qPCR

    Bonjour,

    Je suis dans le même cas que toi, je souhaite comparer deux plaques de qPCR entre elles. Elles ont été faite en même temps.
    Je n'ai pas compris comment tu faisait pour calculer ton facteur de correction.

    Je vous explique mon expérience : j'ai fait 2 plaque de 1536 puits
    A chaque fois j'ai mis 8 marqueurs par plaque (les même sur la plaque 1 et sur la 2). J'utilise 1 seul gène de ménage et des échantillons qui servent de références.
    Ce que je veux faire c'est exprimé certains échantillons de ma plaque deux par rapport à d'autre qui sont sur la plaque 1. Est ce que c'est possible ??

    Merci d'avance.

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